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蛋鸡卵巢组织中ERα动态变化的表观调控及所调节基因的筛选

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符 号 说 明

1前 言

1.1 家禽生殖器官

1.2 性激素对鸡卵巢卵泡的发育影响

1.3 性激素受体对卵巢卵泡发育的影响

1.4 ER作用机制

1.5 基因转录调控研究进展

1.6 本研究的目的意义

2材料与方法

2.1 主要仪器设备

2.2 主要试剂及来源

2.3常用试剂的配制

2.4 实验方法

2.5分子生物学数据库及软件

2.6 统计分析

3结果与分析

3.1 ERα在不同发育时期鸡卵巢的表达规律及其表观调控研究

3.2鸡卵巢ERα诱导表达基因的筛选

4 讨 论

4.1 ERα基因在不同发育时期鸡卵巢和卵泡中的表达规律及其表观调控

4.2性成熟过程中母鸡卵巢中ERα诱导表达基因的筛选

5结 论

6创新点

参考文献

致谢

博士期间学术成果

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摘要

在养鸡生产中，鸡的卵泡发育和成熟的效率是决定鸡开产日龄、产蛋数和休产等繁殖性状的关键因素。在卵泡的生长和排卵过程中，颗粒细胞在促卵泡素等的作用下产生的雌激素与其受体相互作用，诱导卵巢和卵泡生长发育相关基因的表达。雌激素受体包括ERα和ERβ，它们在卵巢中通过不同的分布和含量水平在卵巢、卵泡的生长发育过程中发挥重要作用，但针对雌激素受体介导的鸡产蛋性能相关分子机制的研究较少。 由于在鸡的卵巢和卵泡中，ERα的表达显著高于ERβ；本课题组的前期研究表明， ERα和ERβ在母鸡性成熟过程中不同发育阶段的变化规律不同，提示ERα可能参与母鸡性成熟过程中各阶段的调控，而ERβ主要在鸡性成熟早期发挥作用。因此，本研究采用免疫荧光技术分析了ERα在海兰褐鸡性成熟过程中45d、90d（开产前）和160d（开产后）ERα的变化规律，进一步证实了本实验室的前期研究结果，即ERα在性成熟早期（45d~90d）呈下降趋势，在性成熟后（90d~160d）呈上升趋势，荧光强度主要分布在鸡卵巢皮质层初级卵泡的颗粒细胞层；又采用酶联免疫吸附剂测定方法（ELISA）分析了母鸡血清中雌二醇（E2）的含量，结果显示E2在各个发育阶段母鸡血清中的变化规律与其受体的变化规律基本一致。因此推定ERα是性成熟鸡卵巢卵泡生长发育的关键因素，可诱导与卵泡生长发育相关基因的表达，在卵巢的发育、成熟及排卵过程中发挥重要作用。 那么，是什么因素导致了ERα在鸡不同发育阶段卵巢中呈现那样的动态变化呢？我们进一步对ERα在鸡卵巢中差异表达的表观调控机制进行了分析。1）、采用亚硫酸氢盐测序技术分析了ERα启动子区域的表观遗传修饰情况，结果显示ERα启动子区检测的17个CpG位点中，有2个甲基化水平存在明显差异，但与ERα表达方向不一致，推测启动子区DNA的甲基化未参与ERα的差异表达。2）、采用ChIP-qPCR方法，针对Anti-Histone H3(di+tri methyl K4) antibody、Anti-Histone H3(tri methyl K9)、Anti-Histone H3(tri methyl K36)、Anti-Histone H3(acetyl K27)和Anti-Histone H3(acetyl K9,phospho S10)分析了90d与160d鸡卵巢组织中ERα的组蛋白修饰的差异，显示H3K4二、三甲基化和H3K9磷酸化的修饰水平与ERα表达水平无明显关联；而H3K9三甲基化、H3K27乙酰化及H3K36三甲基化水平在两个时间点的鸡卵巢中差异显著，根据三者的生物学功能判断，最终确定H3K27乙酰化是ERα表达动态的关键修饰，并表明p300的表达变化与ERα基因启动子区H3K27乙酰化修饰的变化相一致。 为进一步揭示ERα在鸡卵巢、卵泡生长发育过程中的作用，我们针对母鸡卵巢中ERα的表达差异性变化，采用ChIP-seq技术从45d、90d和160d母鸡卵巢中筛选出ERα诱导表达的相关基因，同时建立了完善的针对转录因子的ChIP实验中鸡卵巢组织超声破碎方法。测序结果分析显示：1)、45d、90d和160d母鸡中分别筛选到唯一比对序列数占总序列数的82.03%、79.93%和78.38%。2)、将唯一比对序列进行peak扫描分析，不同发育时期鉴定出的结合位点数分别为24886、21680和23348，平均长度为150bp左右，分别占基因组的0.35%、0.3%和0.34%。3)、大部分结合位点功能元件处于基因间及内含子部分，两者总和达80%以上。4)、基序分析显示，每个发育阶段确定的6个基序中，排名第一的基序有15bp几乎相同。排名第二的基序在三个时期都富含AT的结合位点，在45d和90d还富含C序列，而160d的则富含G序列。5)、不同时间点ERα特异性诱导表达的基因数分别为13、20和9。45d与90d其共同诱导表达基因为69，45d和160d共同诱导表达基因为66，90d和160d共同诱导表达基因为66，45d、90d和160d共同诱导表达基因为60。6)、45d与90d，与ERα表达水平相一致的基因有13个，如ATP2A3、TACC1和TAPP2等；在90d和160d，与ERα表达水平相一致的基因有9个；如cRhoB、FCHSD2和FHL1等；在45d和160d，与ERα表达水平相一致的基因有25个，如gga-mir-3534和HTRA3、uc_338等。7)、分析了诱导表达基因参与的队列及相关通路，45d与90d比较，有4个队列和15个通路对应的RDF值小于0.01。90d与160d比较其中有9个队列和14个通路对应的RDF小于0.01。8)、构建蛋白质之间相互作用网络结构，显示在蛋白质网络结构图中包含47个蛋白质节点和164个相互作用边缘。其中在45d与90d下调，但是在90d与160d间无明显差异的的蛋白有18个。在90d与160d下调但是在45d与90d无明显差异的蛋白有18个。在45d与90d下调及在90d与160d都下调的基因有9个。在45d与90d上调但是在90d与160d下调的基因有1个。9)、根据网络结构图的节点数计算蛋白的相互作用，获得了排在前10的网络节点，对应的蛋白分别是AKT1、ACTN2、CREB1、EPHA5、DMD、CDK6、PIK3CG、CTNNA2、APP和CTNNA3。根据不同发育阶段ERα诱导相关表达基因的网络结构图，显示这些筛选的靶基因位于网络调控的核心区域；其中，AKT1基因在母鸡性成熟早期发挥生物学功能，EPHA5和ACTN2在性成熟初期发挥生物学功能，CREB1随着母鸡发育的成熟时间延长，其生物学功能下降。 综上，母鸡性成熟过程中的不同发育阶段，ERα的表达水平存在显著变化，在性成熟早期呈降低趋势，但性成熟后期呈升高趋势。ERα的表达基本不受其启动子区CpG甲基化的影响；H3K27乙酰化是ERα表达表观调控的关键修饰，母鸡卵巢组织中调控ERα基因启动子区H3K27乙酰化修饰的重要因素为p300基因表达的变化。ERα会诱导ATK1、ACTN2、CREB1和EPHA5等基因的表达，这些基因表达的差异是介导母鸡卵巢性成熟发育的关键位点，从而影响鸡的性成熟和卵泡发育。

著录项

  • 作者

    郭淼;

  • 作者单位

    山东农业大学;

  • 授予单位 山东农业大学;
  • 学科 动物遗传育种与繁殖
  • 授予学位 博士
  • 导师姓名 姜运良;
  • 年度 2017
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类
  • 关键词

    蛋鸡; 卵巢组织; 动态变化; 表观调控; 调节基因;

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