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龙胜凤鸡中一株A亚群禽白血病病毒的基因组分析及其对SPF鸡的致病性

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1前言

1.1 禽白血病的研究进展

1.1.1 禽白血病的历史与分布

1.1.2 禽白血病临床特征和病理变化

1.1.3 禽白血病流行病学的特征变化

1.1.4 禽白血病的检测和诊断

1.1.5 禽白血病的防制研究现状

1.2 禽白血病病毒的研究进展

1.2.1 禽白血病病毒的结构与增殖

1.2.2 禽白血病病毒的分型

1.2.3 禽白血病病毒的基因组结构及其功能

1.2.4 禽白血病病毒的致肿瘤机制

1.2.5 禽白血病病毒引起的免疫抑制

1.3 本研究的目的和意义

2材料方法

2.1 材料

2.1.1 病料及毒株来源

2.1.2 细胞

2.1.3试验动物与SPF饲养设施

2.1.4 用于同源性比较的各亚群参考株

2.1.5主要仪器和试剂

2.1.6试剂的配制:

2.2 方法

2.2.1病毒分离

2.2.2病毒的鉴定

2.2.3 病毒扩增定量

2.2.4 SDAU14A1株env基因的扩增、克隆和测序

2.2.5前病毒全基因组DNA的克隆测序及序列分析

2.2.6 分离毒株对SPF鸡的致病性

3结果

3.1 ALV的分离鉴定与定量

3.2 分离毒株env基因的序列分析与亚群确定

3.3 SDAU14A1株前病毒DNA的扩增和序列分析

3.4 不同感染方式下SPF鸡病毒血症动态变化

3.5 SDAU14A1感染对SPF鸡体重的影响

3.6 SDAU14A1感染对鸡免疫功能的影响

3.7感染鸡的发病与肿瘤情况

4.讨论

5.结论

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文

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摘要

禽白血病病毒(ALV)被发现已有一百多年,是最早发现并深入研究的病毒之一。它也是第一个被证实可诱发肿瘤的病毒,该发现获得1996年诺贝尔生理或医学奖。根据ALV细胞受体的特异性和病毒基因组中囊膜蛋白基因将其划分为A-J等十个亚群,并由本实验室在我国地方品系中鉴定到一个暂名为K的新亚群。ALV-J在各种亚群中流行最为广泛,致病性最强,给我国养殖业的发展造成了严重影响。但流行病学调查同时表明,感染禽白血病的鸡群不单单是由ALV-J引起的,也有一些感染鸡群是由ALV-A、B造成的。本研究对于从我国保种的地方品系基因库中分离鉴定到一株A亚群ALV(ALV-A),在完成其全基因分析基础上对其致病性开展了系统研究,这有助于了解我国地方品系鸡群中ALV-A的分子演变规律及其致病性,为我国地方品系中ALV净化提供参考依据。
  1、龙胜凤鸡群中ALV-A的分离鉴定及其序列分析
  为了解中国地方品系鸡中ALV的基因组序列特征及变异情况,本研究通过接种DF-1细胞、间接免疫荧光实验(IFA)和聚合酶链式反应(PCR)等方法,从我国特有地方品系龙胜凤鸡某保种鸡群种蛋中分离到一株ALV-A,命名为SDAU14A1。通过相互直接重叠的引物对不同基因区域进行了扩增和克隆测序,通过拼接获得了其全基因组。将该序列与不同参考毒株进行序列对比,结果显示SDAU14A1与日本矮脚鸡分离株Tyms_90全基因组同源性最高,其U3区同源性达到100%,而与其它中国地方品系鸡分离株同源性较低,暗示该毒株可能代表东亚地区地方品系鸡的某种特有毒株类型。该研究展示出我国地方品系鸡感染ALV的多样性,提示我们有必要实施严格的监控和净化措施,推动我国地方品系鸡中ALV的净化。
  2、ALV-A分离毒株对SPF鸡的致病性研究
  本实验选择卵黄囊接种和1日龄腹腔接种两种攻毒方式系统研究了SDAU14A1对SPF鸡的致病作用,并同时设置了横向传播组和空白对照组观察其横向传播能力。在1w时每只鸡分别接种0.1mL NDV和AIV-H9灭活疫苗,并于免疫后3w、4w、5w采血,分离血清后以HI试验检测针对NDV和AIV-H9抗体效价。第7w时,各组随机选取和剖杀6只鸡称其体重以及法氏囊、胸腺和脾脏的重量,计算免疫器官指数(免疫器官重量/体重)。对自然死亡的鸡剖检并观察,发生肿瘤的鸡将其肿瘤组织制备切片,HE染色后进行病理组织学观察。试验结果显示,相对于空白对照组,病毒感染组能够引起更为显著的生长迟缓和免疫抑制(p<0.05),免疫抑制主要体现在攻毒实验组的胸腺指数和法氏囊指数显著降低以及NDV和AIV-H9疫苗的抗体水平显著降低(p<0.05)。该毒株还可诱发淋巴细胞肿瘤并具有较强的水平传播能力。感染组与空白对照组之间相比差异极显著,但是两种接种方式感染鸡后免疫器官指数差异不显著。

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