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糖皮质激素对肉鸡骨骼肌葡萄糖摄取的影响及机制研究

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本研究利用外源导入糖皮质激素的方法，从体内和体外两个试验模型探讨糖皮质激素对家禽骨骼肌葡萄糖代谢机制的研究。活体试验:一方面通过分离肌肉细胞粗膜、细胞质膜和细胞内膜，探讨葡萄糖转运载体候选蛋白的移位情况;另一方面通过外源导入糖皮质激素的方法，建立应激模型，研究了糖皮质激素和日粮氨基酸对肉仔鸡葡萄糖代谢的影响，以及糖皮质激素、日粮氨基酸及急性灌服葡萄糖对葡萄糖代谢的交互影响，初步探讨了糖皮质激素调控骨骼肌葡萄糖代谢的机制。离体试验:培养鸡胚成肌细胞，通过外源添加特异性抑制剂的方法，研究胰岛素利用MAPK/ERK2途径激活p70S6K、mTOR和PKB/Akt调控家禽骨骼肌葡萄糖代谢的可能性。
　　试验一包括三个小试验:试验1随机挑选体重相近0日龄的AA肉仔鸡150只，分为两个处理:基础日粮添加2.05％L-丙氨酸组和基础日粮添加1％L-精氨酸组。饲养至7日龄，每组挑选体重相近的肉仔鸡112只，设2个小处理:糖皮质激素组和对照组，每个小处理7个重复，每个重复4只鸡。8-14日龄每天8:00和20:00，糖皮质激素组腹部皮下注射DEX(1mg/Kg BM)，对照组注射与糖皮质激素组等体积的生理盐水。14日龄晚20:00禁食12h。结果发现糖皮质激素处理导致家禽生长前期骨骼肌发育受阻，生产性能下降;糖皮质激素处理可使血浆中血糖、NO和INOS含量升高，并且饲喂精氨酸可缓解糖皮质激素的影响。结果表明，糖皮质激素可通过体内的NO信号分子调控骨骼肌的葡萄糖代谢。试验2随机挑选体重相近的0日龄AA肉仔鸡80只，分为两个处理:基础日粮添加2.05％L-丙氨酸组和基础日粮添加1％L-精氨酸组。饲养至7日龄，每个处理挑选体重相近鸡的30只，设有2个小处理:糖皮质激素组和对照组，每个小处理15只鸡。8-14日龄每天8:00和20:00，糖皮质激素组腹部皮下注射DEX(1mg/KgBM)，对照组注射与糖皮质激素组等体积的生理盐水。14日龄晚20:00禁食12h。15日龄早8:00，每组灌服葡萄糖溶液。结果表明，急性灌服葡萄糖可缓解糖皮质激素对血糖的升高作用。试验3挑选体重相近25日龄的AA肉仔鸡48只，随机分为两个组:基础日粮中添加1％L-精氨酸组和基础日粮中添加2.05％L-丙氨酸组，每个组分别设有2个处理:糖皮质激素组和对照组，每个处理12个重复，每个重复1只鸡。25-29预饲喂5天，30-37日龄每天8:00和20:00，糖皮质激素组腹部皮下注射DEX（1mg/kg BM），对照组注射与糖皮质激素组等体积的生理盐水。37日龄20:00禁食12h。试验结果表明，糖皮质激素处理导致家禽生长后期骨骼肌发育受阻，生产性能下降;饲喂精氨酸对糖皮质激质激素造成的应激没有显著地缓解作用。
　　试验二包括四个小试验:试验1包括两个处理，正常培养基和胰岛素(INS，0.1μM，15min)，胰岛素处理岛素处理显著的激活了p70S6K Thr389、mTOR Ser2448和Akt Ser473位点的磷酸化水平，对ERK Tyr204位点的磷酸化水平无显著影响。试验2包括四个处理，正常培养基、胰岛素(INS，0.1μM，15min)、胰岛素和MEK抑制剂(U0126，20uM，1h)以及胰岛素和MEK抑制剂(20uM，2h)，处理后发现，胰岛素处理显著的激活了p70S6K Thr389位点的磷酸化水平，对Akt Ser473和ERK Tyr204位点有激活的趋势，而对mTOR Ser2448位点的磷酸化水平无显著影响;在培养基中加入不同浓度的MEK抑制剂，经过不同处理时间后MEK抑制剂处理显著地抑制了p70S6K Thr389、ERK Tyr204和mTORSer2448位点的磷酸化水;平但是对Akt Ser473位点无显著影响;并且，细胞中的葡萄糖含量在胰岛素处理后有升高的趋势，加入抑制剂后显著降低。试验3可分为正常培养基、胰岛素处理(INS，0.1μM，15min)、胰岛素和Akt抑制剂(5uM，3h)、胰岛素和mTOR抑制剂(RU486，25uM，3h)共同处理。结果发现，胰岛素处理显著的激活了p70S6KThr389和Akt Ser473位点的磷酸化水平，对mTOR Ser2448和ERK Tyr204位点的磷酸化水平无显著影响;在培养基中加入Akt抑制剂后，显著抑制了p70S6K Thr389、mTOR Ser2448和Akt Ser473位点的磷酸化水平，对ERK Tyr204位点的磷酸化水平无显著影响;试验4可分为正常培养基、胰岛素处理(INS，0.1μM，15min)、胰岛素和m-TOR抑制剂(25uM，3h)共同处理。结果发现，胰岛素处理显著的激活了p70S6K Thr389和mTOR Ser2448位点的磷酸化水平，对Akt Ser473和ERK Tyr204位点的磷酸化水平无显著影响;在培养基中加入mTOR抑制剂后，显著抑制了p70S6K Thr389和mTOR Ser2448位点的磷酸化水平，对ERK Tyr204和Akt Ser473位点的磷酸化水平无显著影响。试验二结果表明，胰岛素可能是利用ERK2途径激活p70S6K、mTOR和PKB/Akt，进而调控细胞中的葡萄糖代谢。
　　试验三可分为正常培养基、胰岛素处理(INS，0.1μM，15min)、胰岛素和地塞米松浓度梯度(DEX，500nM，2uM，3h)共同处理。结果显示，胰岛素处理对mTOR Ser2448和ERK Tyr204位点的磷酸化水平无显著影响，对P70S6K Thr389(P=0.0222)位点的磷酸化水平有激活的趋势，显著升高了Akt Ser473位点的磷酸化水平;在培养基中加入糖皮质激素后，抑制了胰岛素诱导的P70S6K Thr389位点的磷酸化水平，对ERK Tyr204和mTORSer2448位点的磷酸化水平无显著影响，说明糖皮质激素对葡萄糖代谢的影响可能是通过调控P70S6K实现的。
　　试验四挑选体重相近的7日龄肉仔鸡40只，随机分为两个组:胰岛素处理组和对照组，每个处理20只鸡。7日龄20:00禁食12h，8日龄早8:00胰岛素处理组腹部皮下注射胰岛素（2U/kg体重），对照组注射与胰岛素组等体积的生理盐水。结果显示，胰岛素处理促进了细胞膜上葡萄糖转运蛋白从质膜向内膜的转运，并且双向电泳结果显示，质膜和内膜上存在重复点，与胰岛素响应的目标蛋白极有可能存在其中。

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