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苹果渣益生菌的筛选及发酵生产微生态制剂的研究

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苹果渣是苹果加工业的主要副产物，我国每年加工产生的苹果渣约有100多万吨，苹果渣资源的合理利用，是促进苹果加工产业高效发展和减少生态环境污染的重要途径。微生态制剂具有改善动物体内微生态平衡、预防疾病、促进生长及净化养殖环境等作用，研发新型微生态制剂，是实现动物饲养安全、健康、无残留污染的无抗养殖的有效途径。本文以苹果渣为原料，研究了自然发酵苹果渣中的微生物组成，分离筛选了有益乳酸菌、酵母菌株，优化了单菌及混菌制备微生态制剂的发酵工艺，初步确定了微生态制剂的质量指标。主要结果和结论如下:
　　1.苹果渣微生物组成分析及发酵益生菌的筛选
　　从自然发酵苹果渣中分离纯化得到10株菌，通过形态学观察、生理生化测定，结合ITS区、26S rRNA和16S rRNA基因序列分析等多相分类法对菌株进行了鉴定。初步确定为:黑曲霉(Aspergillus niger)，白地霉（Galactomyces geotrichum），马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，乳酸乳球菌（Lactococus lactis），青霉（Penicillium paneum），假丝酵母（Candidatartarivorans），植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和东方伊萨酵母（Issatchenkiaorientalis）;其主要微生物组成为酵母菌和乳酸菌。对5株供试菌进行单因素试验，以发酵后菌落总数为指标，确定干酪乳杆菌和马克斯克鲁维酵母为发酵菌株。
　　2.单菌固态发酵工艺条件的优化
　　通过单因素试验，研究了不同氮源对干酪乳杆菌固态发酵的影响，确定了发酵培养基配方为:苹果渣50g/500mL，尿素3％，磷酸氢二钾0.2％，水料比1.2∶1;优化得到干酪乳杆菌苹果渣发酵条件为:接种量7.5％，发酵温度33℃，发酵时间79h，在此条件下进行固态发酵，菌落总数达到6.235×109CFU/g。通过单因素试验，考察了不同氮源对克鲁维酵母固态发酵的影响，确定了发酵培养基配方为:苹果渣40g/500mL，尿素2％，磷酸氢二钾0.3％，水料比1.0∶1;优化得到的克鲁维酵母苹果渣发酵条件为:接种量6.6％，发酵温度28℃，发酵时间73h，在此条件下进行固态发酵，菌落总数达到2.862×109CFU/g。
　　3.混菌固态发酵工艺条件的优化
　　通过单因素试验，研究了不同氮源对苹果渣混菌发酵的影响，并确定了苹果渣发酵培养基配方为:苹果渣39g/500mL，尿素3％，磷酸氢二钾0.3％，水料比1.2∶1。
　　通过单因素和响应面优化试验，确定了苹果渣混菌发酵条件为:接种量9％，接种比1∶2（乳酸菌∶酵母菌），发酵温度30℃，发酵时间92h，在此条件下进行固态发酵，菌落总数达到8.347×109CFU/g。
　　4.菌剂制备及质量稳定性分析
　　采用优化的发酵条件发酵苹果渣，试制菌剂，进行复合酶活和多糖等指标测定。研究显示，干酪乳杆菌发酵的酶活结果为纤维素酶18.05u/g，木聚糖酶35.47u/g，果胶酶56.19u/g;多糖含量为5.90％。克鲁维酵母发酵的酶活结果为纤维素酶30.74u/g，木聚糖酶58.30u/g，果胶酶72.35u/g;多糖含量为7.30％。混菌发酵的酶活结果为纤维素酶49.21u/g，木聚糖酶95.13u/g，果胶酶126.30u/g;多糖含量为10.80％;经稳定性试验，菌量均保持在108CFU/g。

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