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拟南芥RopGEF4和RopGEF10介导的根毛的生长

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摘要

1 前言

1.1 根毛研究现状

1.2 拟南芥根毛的发生基础

1.2.1 根毛细胞的分化基础

1.2.2 根毛细胞的极性生长

1.3 小G蛋白在根毛生长中所起的作用

1.3.1 小G蛋白的种类和功能

1.3.2 小G蛋白的调节机制

1.3.3 小G蛋白对根毛生长的影响

1.4 ROS对根毛的生长是必须的

1.4.1 NADPH氧化酶对根毛的生长和发育是必需的

1.4.2 ROS在scn1中的分布呈现扩大化的趋势

1.5 发育信号和环境信号对根毛生长的影响

1.5.1 生长素对根毛的影响

1.5.2 营养元素对根毛生长的影响

1.6 RLK对根毛生长的影响

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株与质粒

2.1.3 酶与各种生化试剂

2.2 实验方法

2.2.1 植物基因组的提取与纯化

2.2.2 载体构建

2.2.3 PCR鉴定纯合突变体植株

2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2.2.5 大肠杆菌中质粒的提取

2.2.6 农杆菌感受态细胞的制备和转化

2.2.7 拟南芥的转化及转基因拟南芥的鉴定

2.2.8 RNA的提取纯化与反转录

2.2.9 半定量PCR和实时定量PCR

2.2.10 ROS荧光强度的测定

2.2.11 FM4-64染色分析

2.2.12 植物体内活性小G蛋白的提取和检测

2.2.13 对植物进行磷处理

3 结果与分析

3.1 GEF4和GEF10突变体鉴定及表型分析

3.2 在gef4gef10突变体中,ROS和活性小G蛋白的量明显减少

3.3 GEF4和GEF10过表达的表型分析

3.4 GEF4和GEF10结构域的功能分析

3.5 FER对生长素和磷的响应不依赖于GEF4和GEF10

3.6 FER在gef4gef10中过表达,ROS的产量降低

3.7 本实验的模型

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况

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摘要

根毛作为植物伸出体外的管状细胞,在吸收水分和营养物质,固定植物及感受外界信号的过程中起着重要作用。
   根毛提供了一个优秀的体系去研究基本的生物问题,例如,细胞命运的决定、根毛的起始和极性生长。在已有的研究中,报道了大量与根毛生长和发育有关的突变体,根毛数目增多的突变体:gl2,ttg,wer,pom1;根毛数目减少的突变体:cpc,rhl1,rhl2,rhl3;根毛分叉的突变体:cow1,cen1,cen2,cen3,lrx1,rhd1,rhd3;根毛呈波浪形弯曲生长的突变体:rhd4,arp2,agd1。
   根毛的生长和发育受到多方面因素的影响,活性小G蛋白对根毛的极性生长起到分子开关的作用,对根毛的发育起到一个关键性的作用。通过由非活性状态到活性状态的转变,活性小G蛋白调控广泛的细胞活动,例如微丝的聚合,ROS的产生和钙的浓度梯度的维持。
   本论文以拟南芥为研究材料,在以下五方面研究了根毛中存在的信号途径FER-GEFs-ROP-ROS:
   (1)尽管GEF4和GEF10作为同一家族在根毛中高量表达的的基因,但GEF4和GEF10在根毛的发育过程中发挥不同的作用。
   (2)为了放大GEF4和GEF10之间功能的不同。我们使用了根毛特异性的强启动子EXPA7,驱动的GEF4和GEF10在根毛内的过表达。通过对GEF4和GEF10过表达的表型进行分析,我们发现,GEF4过表达的植物根毛呈现显著弯曲的表型,GEF10过表达的植物根毛呈现显著分叉的表型。
   (3)通过对GEF4和GEF10的二级结构分析和区域互换实验,我们证明N端对GEF4的功能是必不可少的,C端对GEF10的功能是必不可少的。
   (4) FER在gef4gef10中过表达植物根毛中ROS的含量,显著地低于FER在野生型中过表达根毛中的ROS含量。从遗传上,我们证明FER位于GEF4和GEF10的上游,通过GEF4和GEF10进而参与ROS的调控。
   (5)对gef4gef10和fer-4进行生长素和低磷诱导的胁迫处理,我们发现,fer-4不响应生长素的诱导和低磷胁迫的处理,gef4gef10对生长素的诱导和低磷的胁迫处理,呈现敏感性的响应。由此我们得出结论,FER感受生长素和低磷胁迫,调节根毛的生长和发育,但并不依赖于GEF4和GEF10。

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