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基于适配体和酶辅助的荧光信号放大进行膜蛋白的高灵敏均相检测

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第一章 绪 论

1.1 膜蛋白检测意义和分析方法

1.2 基于核酸适配体进行膜蛋白检测的荧光分析法研究进展

1.3 本论文的研究内容

参考文献

第二章 基于核酸适配体和内切酶辅助的荧光信号放大检测细胞膜蛋白

2.1 引 言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 结 论

参考文献

第三章 基于微液滴系统的单细胞膜蛋白高灵敏均相检测

3.1 引 言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 结 论

参考文献

作者发表的学术论文及参加的课题

致谢

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摘要

膜蛋白是生物膜的重要组成部分,在一系列生理功能如分子识别、能量传递和离子调控等方面发挥着重要作用。而且,膜蛋白也是一种潜在的癌症标志物和主要的药物靶点,很多疾病与膜蛋白的异常表达有关。因此,发展高灵敏的膜蛋白定量分析方法对于疾病诊断、药物研究等方面具有重要的意义。
　　核酸适配体是利用指数富集配体系统进化技术(SELEX)从体外筛选得到的寡核苷酸片段,已用于蛋白质的检测和其它生物应用。它能和蛋白质特异性结合,与抗体相比具有很多明显的优势。酶的信号放大技术是一种高灵敏的检测方法,已用于核酸、蛋白质和小分子的检测,在生化分析和临床诊断中发挥了极大的作用。
　　本文综述了基于核酸适配体进行膜蛋白检测的荧光分析法的研究进展。在此基础上,利用核酸适配体的识别作用和内切酶辅助的荧光信号放大技术进行细胞膜蛋白的高灵敏均相检测,开展了以下几个体系的研究:
　　1.设计了一种基于核酸适配体和内切酶辅助的荧光信号放大进行细胞膜蛋白的高灵敏均相检测的方法。该检测体系用到两种探针:发夹型探针和信号探针。发夹型探针由三部分组成:与膜蛋白PTK7结合的适配体sgc8、连接序列和用于扩增的 DNA序列。信号探针是双标记猝灭型探针,两端分别标记荧光团 FAM和猝灭团 ECLIPSE。当目标蛋白不存在时,发夹型探针两端碱基互补配对,形成稳定的茎环结构。但加入 Hela细胞后,由于适配体和细胞膜蛋白PTK7结合,导致发夹型探针发生构象变化,进而释放出扩增序列。首先,信号探针与扩增序列杂交,形成了切刻内切酶 Nb.BbvCI的识别位点。然后,酶与该位点结合后,只切割信号探针。由于切割的信号探针不能稳定存在,与扩增序列分离,导致荧光团和猝灭团距离增大,从而产生了荧光信号。扩增序列能继续和未反应的信号探针结合,重复这一过程,进行循环放大,使最终的荧光信号大大增强。该方法通过循环放大提高了检测的灵敏度,能实现均相检测,不需要复杂的冲洗和分离步骤,易于操作。检测限低至19 pM。
　　2.设计了一种基于微液滴系统进行单细胞膜蛋白的高灵敏均相检测的方法。为了实现高通量的单细胞分析,微液滴作为一个独立的反应器,为反应提供了限域空间,实现了单细胞检测。设计了一种用于液滴产生的PDMS芯片,其中,三个水相入口分别通入反应混合液,缓冲溶液和酶溶液,油相入口通入正十四烷和2％span80的混合液,通过调节水相和油相的流速,形成了均一稳定的液滴。在芯片的弯形通道内,三种溶液迅速混合,基于适配体和酶辅助的荧光信号放大反应迅速发生,从而产生放大的荧光信号。用激光诱导荧光检测液滴产生的荧光信号,根据泊松分布,确定液滴包裹单细胞的信号,对单细胞膜蛋白 PTK7进行定量。与大量细胞检测相比,皮升级的液滴使反应速率提高了两个数量级,大大减少了试剂的消耗。实验结果得到单个 Hela细胞膜蛋白PTK7的量为5.7×10-19~7.9×10-19 mol。

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