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人角膜内皮细胞体外增殖的影响因素、分子机理及其激活途径研究

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摘要

第一章 文献综述

1 人角膜内皮和人角膜内皮细胞

1．1 人角膜内皮的结构与功能

1．2 人角膜内皮细胞独有的形态特征

2 人角膜内皮细胞的增殖能力及其影响因素

2．1 人角膜内皮细胞的增殖能力

2．2 接触抑制对人角膜内皮细胞增殖能力的抑制作用

2．3 TGF-β2对人角膜内皮细胞增殖能力的抑制作用

2．4 生长因子对人角膜内皮细胞增殖能力的影响

2．5 DNA氧化损伤对人角膜内皮细胞增殖能力的影响

3 刺激人角膜内皮细胞增殖的研究进展

3．1 解除接触抑制对人角膜内皮细胞增殖的激活研究

3．2 持续的生长因子刺激对人角膜内皮细胞增殖的激活研究

3．3 解除G1期抑制对人角膜内皮细胞增殖的激活研究

3．4 其他因素对人角膜内皮细胞增殖的激活研究

4 人角膜内皮细胞的光损伤及其抗氧化保护剂

5 本研究的目的和意义

第二章 解除细胞接触抑制对人角膜内皮细胞体外增殖能力的影响作用研究

1 实验材料与用品

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

1．3 实验药品及试剂

1．4 几种主要溶液的配方

2 实验方法

2．1 细胞接触抑制对人角膜内皮细胞增殖的影响作用研究

2．2 EDTA解除接触抑制对HCE细胞的影响作用研究

2．3 Y-27632对EDTA处理人角膜内皮细胞的影响作用研究

2．4 接触抑制人角膜内皮细胞中ROCK1及CKI的Western blot检测

3 实验结果

3．1 接触抑制对人角膜内皮细胞增殖的影响作用

3．2 EDTA对接触抑制的人角膜内皮细胞的影响作用

3．3 Y-27632对EDTA处理人角膜内皮细胞的影响作用

3．4 Y-27632及EDTA对人角膜内皮细胞中ROCK1和CK1表达的影响作用

4 讨论

5 结论

第三章 TGF-β2对人角膜内皮细胞体外增殖能力的影响作用及其分子机理研究

1 实验材料与用品

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

1．3 实验药品及试剂

1．4 几种主要溶液的配方

2 实验方法

2．1 TGF-β2对人角膜内皮细胞增殖的影响作用研究

2．2 TGF-β2调控HCE细胞增殖的信号通路研究

3 实验结果

3．1 TGF-β2对人角膜内皮细胞增殖活性的影响作用

3．2 Smad信号通路在TQF-β2调控人角膜内细胞增殖中的作用

4 讨论

5 结论

第四章 人角膜内皮细胞氧化损伤的保护

1 实验材料与用品

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

1．3 实验药品及试剂

1．4 几种主要溶液的配方

2 实验方法

2．1 建立人角膜内皮细胞的UVB诱导损伤模型

2．2 UVB照射诱导人角膜内皮细胞损伤的机理研究

2．3 抗氧化剂对人角膜内皮细胞氧化损伤的保护作用研究

3 实验结果

3．1 UVB照射对人角膜内皮细胞的影响作用

3．2 UVB诱导人角膜内皮细胞氧化损伤的分子机理

3．3 抗氧化剂对UVB诱导的人角膜内皮细胞氧化损伤的保护作用

4 讨论

5 结论

全文总结

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致谢

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摘要

现有研究结果显示，成年后已丧失增殖能力的HCE细胞虽然被拘留在细胞周期的G1期，但仍保留有激活后恢复增殖的潜能。许多研究证实，接触抑制和TGF-β2是体内抑制HCE细胞增殖的主要原因，解除其接触抑制状态和加入TGF-β2抑制剂能够刺激HCE细胞重新恢复增殖能力，但其具体作用效果和分子机理仍有待于进一步研究。除眼睛内部的影响因素以外，太阳光中的紫外线(UV)也会对HCE细胞造成一定的氧化损伤作用，很可能也是导致HCE细胞增殖能力下降和逐年死亡的原因之一，但其损伤作用强度和分子机理至今仍不清楚。因此，急需研究和揭示接触抑制、TGF-β2及UV氧化损伤对HCE细胞增殖能力的具体影响作用及其分子机理，但遗憾的是，由于缺少HCE细胞的体外研究模型，致使无法开展这些研究。
　　本文以我们业已建立的非转染HCE细胞系作为体外研究模型，研究接触抑制、不同浓度TGF-β2及UV氧化损伤对HCE细胞增殖能力的影响作用及其分子机理，并先后采用EDTA联合Rho激酶抑制剂Y-27632解除接触抑制，利用Smad抑制剂SB431542阻断TGF-β2的信号传导，以及使用抗氧化保护剂抗坏血酸-2-磷酸酯(Asc-2P)使细胞免受UV氧化损伤，旨在揭示HCE细胞增殖抑制的分子机理以及恢复增殖的有效途径或方法。
　　为了揭示接触抑制对HCE细胞增殖抑制作用的分子机理以及解除接触抑制对HCE细胞增殖能力的恢复作用，本文首先利用第70代非转染HCE细胞体外培养5天建立了HCE细胞的接触抑制模型，进而利用该模型研究了EDTA解除接触抑制对HCE细胞增殖能力的恢复作用，以及Rho激酶抑制剂Y-27632对EDTA处理HCE细胞形态和功能的保护作用。对接触抑制形成前后HCE细胞增殖能力的EdU检测结果显示，HCE细胞的增殖数量随着培养天数的增加而逐渐减少，并在第5天形成接触抑制后全部停止增殖，且在光镜下形成连续的汇合单层，表明体外培养第5天所形成的汇合单层HCE细胞可以作为接触抑制模型用于后续实验研究。EDTA处理HCE细胞的光镜检测结果显示，0.2～2 mg/ml EDTA能够浓度依赖性的导致细胞收缩变圆甚至脱落，并在恢复过程中发生成纤维样转变;细胞骨架免疫荧光染色结果证实，0.2～2 mg/ml EDTA能够使HCE细胞中肌动蛋白丝和微管的荧光强度显著增加、长度明显变长，细胞形态发生成纤维样转变，并且具有浓度依赖性;EdU渗入检测结果显示，0.2～2 mg/ml EDTA能够显著促进HCE的增殖（P＜0.01）;细胞功能蛋白的免疫荧光结果显示，0.2 mg/ml EDTA能够使ZO-1、Na+/K+-ATPase和N-Cadherin的表达大量减少并发生定位改变;Western blot结果显示，EDTA解除接触抑制后，HCE细胞中ROCK1表达量显著增加，p27Kip1、p21Cip1和p16INK4a表达量显著减少（P＜0.01）。以上结果表明，EDTA虽然可以解除HCE细胞接触抑制并使其恢复增殖，但会导致细胞脱落及形态和功能改变。Y-27632处理HCE细胞的光镜观察和生长曲线检测结果发现，5～10μMY-27632能够浓度依赖性地促进HCE细胞的贴壁和伸展，缩短HCE细胞的迟缓期、延长平台期并推迟衰退期。EDTA联合Y-27632处理HCE汇合单层的检测结果显示，5～10μMY-27632能够浓度依赖性地防止HCE细胞由EDTA处理所引起的脱落，促进EDTA处理后HCE细胞增殖能力的恢复(P＜0.01)，并在HCE细胞的恢复过程中维持其多边形形态和功能蛋白的正常表达和定位，同时，Y-27632还能够显著抑制HCE细胞中ROCK1、p27Kip1、p21Cip1和p16INK4a的表达(P＜0.01)。这表明，Y-27632能够抑制细胞分离所导致的脱落，维持HCE正常的形态结构及生理功能并延缓HCE细胞衰退。以上结果表明，ROCK1和p27Kip1参与了HCE细胞接触抑制的调控，Y-27632联合EDTA能够安全有效的解除HCE细胞的接触抑制，使HCE细胞恢复增殖能力，并延缓HCE细胞衰退。
　　为了揭示TGF-β2对HCE细胞增殖抑制作用的分子机理并探讨通过阻断TGF-β2的信号传导通路使HCE细胞恢复增殖的可行性。本文首先确定了TGF-β2对体外培养的非转染HCE细胞的增殖抑制作用，进而研究了TGF-β2信号通路抑制剂对HCE细胞增殖能力的恢复作用。TGF-β2处理HCE细胞的MTT检测结果显示，TGF-β2在浓度大于0.2 ng/ml时对HCE细胞活力具有显著的抑制作用(P＜0.05)，而EdU渗入结果也证实，0.2 ng/ml TGF-β2能显著抑制HCE细胞增殖（P＜0.05）。 Smad抑制剂SB431542和p38MAPK抑制剂SB203580与TGF-β2联合处理HCE细胞的EdU渗入结果显示，SB431542在浓度高于50 nM时能够显著解除0.2 ng/ml TGF-β2对HCE细胞增殖的抑制作用（P＜0.05），而SB203580对TGF-β2的HCE细胞增殖抑制没有显著影响;Western blot检测结果显示，TGF-β2能够显著上调Smad2和Smad3的表达(P＜0.05)及其磷酸化(P＜0.01)，显著上调Smad7(P＜0.05)、p27Kip1和p21Cip1的表达（P＜0.01），SB431542能够显著抑制Smad2和Smad3的表达及磷酸化(P＜0.01)，并显著抑制Smad7(P＜0.05)、p27Kip1和p21Cip1的表达(P＜0.01)。以上结果表明，p27Kip1和p21Cip1参与了TGF-β2对HCE细胞增殖抑制的调控，TGF-β2对HCE细胞的增殖抑制作用是通过Smad通路介导的，SB431542能够解除TGF-β2对HCE细胞的增殖抑制作用。
　　为了揭示UVB氧化损伤导致HCE细胞增殖能力下降的分子机理并探讨通过抗氧化保护剂降低UVB氧化损伤使HCE细胞恢复增殖能力的可行性，本文首先利用体外培养的非转染HCE细胞建立了UVB氧化损伤模型，进而利用该模型研究了抗氧化保护剂对HCE细胞氧化损伤的保护作用及增殖能力的恢复作用。UVB照射HCE细胞的光镜观察结果显示，12.5～800 mj/cm2 UVB能够抑制HCE细胞生长分裂，诱导HCE细胞发生皱缩、变圆甚至脱落，且具有辐射剂量和时间依赖性，当UVB辐射剂量大于200mj/cm2，照射时间超过12 h时能够诱导HCE细胞发生不可逆损伤;MTT检测结果显示，UVB能够辐射剂量和时间依赖性的使HCE细胞活力显著下降(P＜0.01)，这表明，UVB能够诱导HCE细胞发生损伤，降低HCE细胞的增殖能力。200mj/cm2和400 mj/cm2 UVB照射处理HCE细胞的8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)免疫荧光染色结果显示，UVB能够显著诱导HCE细胞发生DNA氧化损伤（P＜0.01），且主要发生在核DNA;二氢乙啶(DHE)染色观察结果发现，UVB能够显著提高HCE细胞内的ROS水平（P＜0.01），具有辐射剂量和时间依赖性，并且ROS能够在HCE细胞内发生积累;Western blot检测结果显示，UVB能够显著上调HCE细胞中p53和p21Cip1的表达及p53的磷酸化(P＜0.01)。由此可见，UVB对HCE细胞的氧化损伤是通过诱导ROS的产生来实现的，进而通过上调p53和p21Cip1的表达抑制HCE细胞的增殖。抗氧化保护剂黄酮(Flavone)、原花青素(PC)、抗坏血酸(Asc)和抗坏血酸-2-磷酸(Asc-2P)处理HCE细胞的MTT结果显示，Asc-2P对HCE细胞没有毒副作用且能使HCE细胞活力显著提高(P＜0.01)，提高HCE细胞活力的有效浓度为1.5 mM。对Asc-2P预处理后经UVB照射处理的HCE细胞的检测结果显示，Asc-2P能够减少HCE细胞的脱落和死亡、促进HCE细胞形态和生长的恢复、显著降低DNA的氧化损伤(P＜0.01)和细胞中的ROS水平(P＜0.01)，并显著下调UVB诱导的p53和p21Cip1的表达以及p53的磷酸化(P＜0.01)。上述结果表明，UVB能够诱导HCE细胞产生ROS，从而引起HCE细胞DNA的氧化损伤，并通过上调p53和p21Cip1的表达抑制HCE细胞增殖，而Asc-2P能够降低UVB照射HCE细胞的ROS水平，减少HCE细胞DNA氧化损伤，下调p53和p21 Cip1表达，并促进HCE细胞增殖能力的恢复。
　　综上所述，本文以我们自建的非转染HCE细胞系为体外研究模型，揭示了接触抑制、TGF-β2和氧化损伤调控HCE增殖的分子机理，建立了通过安全解除接触抑制、阻断TGF-β2的信号传导和保护氧化损伤使HCE细胞恢复增殖能力的方法。本研究证明非转染HCE细胞能够作为有效的体外研究模型被应用于HCE细胞增殖及氧化损伤的研究，本文的研究结果对于刺激体内HCE细胞增殖能力恢复，维持HCE单层的细胞密度、角膜的透明度及视敏度具有重要的参考价值，并且也为HCE细胞增殖与氧化损伤调控机理的深入研究奠定了理论基础。

著录项

  • 作者

    温茜;

  • 作者单位

    中国海洋大学;

  • 授予单位 中国海洋大学;
  • 学科 海洋生物学
  • 授予学位 博士
  • 导师姓名 樊廷俊;
  • 年度 2015
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 R329.28;
  • 关键词

    人角膜内皮; 细胞增殖; 分子机理; 氧化损伤;

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