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利用牙鲆鳃细胞系和斑马鱼胚胎检测和评估青岛沿海底沉积物的细胞毒性、遗传毒性和胚胎致畸性

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第一章 文献综述

1 海底沉积物中的有机污染物的特征

2 海底沉积物中有机污染物的种类

2.1 多环芳烃的物化特性、危害及来源

2.2 有机氯化合物物化特性、来源及危害

3 环境中污染物的研究方法

3.1 化学方法

3.2 生物学方法

4 牙鲆鳃细胞系研究背景

5 论立题依据、内容和意义

第二章 青岛沿海海底沉积物的采集,有机混合物的提取及多环芳烃的测定

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料和试剂

2.2 实验方法

3 结果

4 讨论

4.1 青岛沿海海底沉积物中有机污染物的来源

4.2 青岛沿海海底沉积物与世界各海域沉积物中PAH含量的比较

第三章 青岛沿海海底沉积物中的有机混合物对FG细胞系的细胞毒性影响

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料和试剂

2.2 实验方法

3 统计学分析

4 结果

5 讨论

第四章 青岛沿海海底沉积物中的有机混合物对FG细胞系的遗传毒性影响

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料和试剂

2.2 实验方法

3 统计学分析

4 结果

5 讨论

第五章 青岛沿海海底沉积物中的有机混合物对斑马鱼胚胎的致畸致死毒性影响

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料和试剂

2.2 实验方法

3 统计学分析

4 结果

4.1 青岛沿海海底沉积物中有机混合物对斑马鱼胚胎致死作用

4.2 青岛沿海海底沉积物中有机混合物对斑马鱼胚胎致畸作用

5 讨论

结论

参考文献

致谢

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摘要

人类活动导致的各种污染物,最终会进入水生生态系统中,其中一些难溶解和难挥发性的污染物会沉积在海底沉积物中。海底沉积物中的污染物会直接对底栖生物产生毒害,或通过生物富集作用和食物链的传递作用,最终影响到人类的身体健康。因此,发展和完善有效的生物检测系统,对于开展海底沉积物的毒性检测和毒理学研究,具有重要的理论和实际意义。
   首先,本文在青岛沿海选取了3个污染程度不同的站点:工业污染严重的李沧河入海口处(简称LC)、栈桥附近的泊船码头海域(简称ZQ)和娱乐场所奥帆中心附近海域(简称OSC),分别采集海底沉积物,采用超声震荡法抽提沉积物中的有机混合物,然后通过气相色谱和质谱分析了以上3个有机抽提混合物中的16种多环芳烃(PAH)的含量。结果显示LC、ZQ和OSC 3个样品中的PAH总含量分别为4032.62 ng/g干重、1154.6 ng/g干重和407.75 ng/g干重,其中LC和ZQ两站点的5-6环的PAH种类和含量要明显多于OSC站点。这表明,从PAH水平来看,LC站点的污染程度最高,其次是ZQ,OSC污染程度最低。
   其次,本文利用体外培养的牙鲆鳃细胞系(FG)来检测3个站点海底沉积物中有机提取混合物的细胞毒性。MTT实验的结果表明:3个站点的沉积物有机提取混合物对FG细胞的毒性都呈现出浓度依赖性;其中,LC、ZQ和OSC 3个样品的最低效应浓度分别为1.5、12.5和125 mg干重(沉积物)/ml(培养基);LC、ZQ和OSC 3个样品对FG细胞的24小时半抑制浓度(24-h IC50)分别为44.87、109.14和1080.19 mg干重/ml。可见,3个站点沉积物的有机提取混合物对FG细胞的细胞毒性大小为LC>ZQ>OSC。
   再次,本文通过彗星电泳实验检测了3个站点沉积物的有机提取混合物对FG细胞的遗传毒性效应。3个站点的不同浓度有机提取混合物处理FG细胞的结果表明:3个样品对FG细胞的遗传毒性都呈现出浓度依赖性;LC、ZQ和OSC 3个样品对FG细胞的遗传毒性的最低效应浓度分别为0.5、10和200 mg干重/ml;LC、ZQ和OSC 3个样品的彗星数值分别为26-211,22-157和18-99。可见,3个站点沉积物的有机提取混合物对FG细胞的遗传毒性大小为LC>ZQ>OSC。同时,为了解以上3个样品在相似的细胞毒性条件下,其遗传毒性的大小及其时间依赖性,_我们选取5 mg干重/ml的LC、20 mg干重/ml的ZQ和200 mg干重/ml的OSC处理FG细胞96小时。结果表明,3个样品对FG细胞的遗传毒性都具有时间依赖性,但却有明显的差异。FG细胞在经LC和ZQ的两浓度处理后,6小时便出现与对照组显著性差异(P<0.05),但是OSC样品处理的细胞在24小时后才出现显著性差异。其中,在检测的每个时间点上,LC和ZQ两样品的遗传毒性都要明显高于OSC样品。可见,具有相似细胞毒性的3个样品产生了不同的遗传毒性,即细胞毒性和遗传毒性是不一致的。
   最后,本文利用斑马鱼胚胎,研究了以上3个站点沉积物的有机提取混合物对鱼类胚胎的致畸致死毒性效应。结果表明,3个样品对斑马鱼胚胎都具有致畸和致死作用,并呈现出浓度依赖性。24小时斑马鱼胚胎致死性实验的结果表明,LC、ZQ和OSC3个样品的最低效应浓度分别为5、10和300mg干重/ml,24小时半致死浓度(24-h LC50)分别为22.08、48.32和704.25 mg干重/ml。可见,3个站点沉积物的有机提取混合物的致畸毒性大小为LC>ZQ>OSC。
   为了比较以上3个样品对斑马鱼胚胎的致畸毒性,我们同样选择了具有相似细胞毒性的3个浓度(LC:5 mg干重/ml,ZQ-20mg干重/ml,OSC:200 mg干重/ml)来处理斑马鱼胚胎。致畸实验的结果表明,以上这3个样品的3个浓度都能引起胚胎发育畸形,甚至导致胚胎死亡,但却有明显的差异,其中LC和ZQ两样品的致畸毒性要明显高于OSC样品。同样,以上3个样品在细胞毒性相似的条件下,对斑马鱼胚胎的致畸毒性是不一样的;由于五环和六环的多环芳烃在LC和ZQ两站点含量要明显高于OSC样点,并且五环和六环的多环芳烃已被证明具有较高的致畸致癌作用,因此我们推断胚胎致畸毒性呈现出差异的原因可能是与沉积物中5环和6环的多环芳烃有关。
   最早观测到胚胎发育出现异常是在受精后9小时,对照组已经大部分发育到90%外包时期,而处理组三个浓度胚胎都呈现出不同程度的发育延迟,有的只发育到75%或50%外包阶段;在受精后24小时,LC、ZQ和OSC的畸形率分别为30.0±5.0%、25.0±5.0%和10.0±7.6%,死亡率分别为20.0±5.0%、12.0±7.6%和3.0±2.8%,远远大于对照组(畸形率和致死率分别为5.0±1.2%和3.0±2.8%);受精后48小时的畸形率分别为LC:45.0±5.0%,ZQ:30.0±2.896和OSC:20.0±5.0%,死亡率分别为LC:25.0±10.0%,ZQ:20.0±5.0%和OSC:8.0±2.8%;受精后72小时,LC、ZQ和OSC三样品的孵化率都有所下降,分别为27.0±7.6%,43.0±7.6%和80.0±5.0%,远远小于对照组(92.0±5.8%);
   总之,本文通过体外培养鱼类细胞实验、彗星试验和斑马鱼胚胎实验来比较和检测青岛沿海海底沉积物的污染状况,发现,3个样品的细胞毒性、遗传毒性和致畸毒性大小的顺序相同,都为LC>ZQ>OSC。而且,3种实验方法得到了相似的最低效应浓度,表明这三种检测方法具有相似的敏感性。同时,我们还发现以上三个样品在相似的细胞毒性的条件下,却产生了不同的遗传毒性和致畸毒性,表明沉积物的细胞毒性,遗传毒性和致畸毒性是不能等同的遗传毒性检测终点。最后,我们推测PAH的含量与沉积物的毒性有一定的相关性,PAH含量高的沉积物样品,其毒性也越大。但是PAH只是沉积物中污染物的一部分,只发挥一定的作用,可能不是导致沉积物出现毒性的唯一原因。

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