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鱼皮胶原蛋白的制备及胶原蛋白多肽活性的研究

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前言

1文献综述

2鱼皮胶原蛋白的提取及理化性质

3水解制备鱼皮胶原蛋白多肽及多肽的清除自由基活性

4鱼皮胶原蛋白多肽抗衰老活性

5鱼皮胶原蛋白多肽的抑制血管紧张素转换酶(ACE)活性

6鱼皮胶原蛋白多肽慢性降压作用

7鱼皮胶原蛋白多肽对血管内皮细胞损伤的保护作用

8鱼皮胶原蛋白多肽抗肿瘤活性的测定

9结论

参考文献

本论文的特色及创新之处

博士在读期间发表的文章

致谢

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摘要

本文主要是利用酶工程技术,以资源较多并且集中的鱿鱼、鳕鱼和鲤鱼为主要的利用对象,通过选择适宜的蛋白酶和控制酶解过程,研究开发水产胶原蛋白及其寡聚肽制品。 首先,分别以鱿鱼皮、鳕鱼皮和鲤鱼皮为原料,通过采用不同提取方法提取胶原蛋白,并对所提取的鳕鱼皮、鱿鱼皮和鲤鱼皮的胶原蛋白的理化性质进行测定,电泳测定鳕鱼皮、鱿鱼皮和鲤鱼皮胶原蛋白的分子量分别为220 kDa、220 kDa和260 kDa,测定了鲤鱼皮、鱿鱼皮和鳕鱼皮胶原蛋白的热变性温度(Td)分别为31.9℃、26.8℃和24.2℃。 其次,采用不同的酶解工艺条件,制备生理活性不同的胶原蛋白多肽产物。确定了制备具有清除自由基活性的鱼皮胶原蛋白多肽的最佳酶解工艺条件:采用碱性蛋白酶properase E作为水解用酶,水解pH9.0,水解温度为45℃、酶与底物比为1:50,水解时间为3 h。选用双酶A(properase E)和B(胃蛋白酶),进行复合酶解试验,得到的水解产物无论是对羟自由基还是超氧阴离子自由基都有最高的清除活性。 选用截留分子量分别为10k、6k和2kDa的超滤膜,对鱼皮胶原蛋白水解产物进行超滤粗分离,实验结果表明,不同分子量范围的多肽组分对O<,2><'·->。和·OH清除活性不同,清除活性随分子量的减小而增大。测定了不同水解条件对于胶原蛋白多肽产率的影响,在温度55℃,pH值为8.0,酶与底物浓度比为4[％]的条件下,用碱性蛋白酶properase E水解鱼皮胶原蛋白多肽产率最高。 以ACE抑制活性为指标,确定酶解制备胶原蛋白ACE抑制肽的最佳反应条件为:酶与底物比为2[％]、pH为2.0、水解温度为45℃、水解时间5 h。采用两种酶,胃蛋白酶和碱性蛋白酶进行复合水解得到的多肽的ACE抑制活性高于单酶水解得到的产物。采用不同截留分子量的膜对水解液进行超滤分离,经截留分子量不同的膜分离后,分子量小于2000Da(UF-2)和分子量2000-6000Da(UC-2)组分对ACE的抑制率都很高,IC<,50>可以达到0.71 mg/mL和0.79 mg/mL,较未经超滤处理的水解原液来说有显著降低。考察了不同的水解条件对于多肽产率的影响,试验结果表明,温度因素对于多肽产率的影响最大,在温度55℃,pH值为2.5，酶与底物浓度比为2％的条件下，用胃蛋白酶水解鱼皮胶原蛋白的多肽产率最高。 对鱼皮胶原蛋白多肽进行生物学活性实验。研究了鱿鱼皮胶原蛋白多肽分子量小于2000Da组分在D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠体内抗氧化活性。结果表明胶原蛋白多肽在小鼠体内对D-半乳糖诱导的衰老有很好的抑制作用。可使小鼠血液和皮肤中的抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性增强，提高抗氧化体系对过多的自由基的清除作用，提高小鼠皮肤组织中羟脯氨酸的含量。 鱼皮胶原蛋白多肽Mw<2000Da的组分，通过长期预防给药的试验表明，可以显著的降低肾血管性高血压大鼠的动脉血压，并能显著降低大鼠血浆中AngⅡ的含量，具有较好的降压效果，呈剂量依赖性，200μg/g剂量的降压效果与卡托普利14μg／g相当。 鱼皮胶原蛋白多肽对于血管内皮细胞的损伤具有一定的保护和修复作用，并且随着多肽浓度的增加，作用增强。鱼皮胶原蛋白多肽对于细胞生长来说，没有细胞毒性作用，基本不能抑制肿瘤细胞P388和A549的生长和增殖。

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