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【6h】

缺氧条件下肝癌细胞中基因DEC1、HIF-1α、PCNA、Survivin差异表达的研究及其意义

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摘要

符号说明

前言

材料与方法

1．实验材料

1．1 主要仪器及耗材

1．2 主要试剂

1．3 主要试剂配制

1．4 细胞系

2．实验方法

2．1 细胞培养及实验分组

2．2 实时荧光定量PCR

2．3 免疫细胞化学染色

2．4 Western Blot

2．5 统计学分析

实验结果

1．转录水平的表达情况

1．1 各引物标准曲线、溶解曲线及扩增效率

1．2 正常氧含量条件下各基因mRNA的表达

1．3 不同缺氧时间对各基因的mRNA表达的影响

2．翻译水平的表达情况

2．1 DEC1、HIF-1α、PCNA和Survivin蛋白的免疫细胞化学定位

2．2 Western Blot对肝癌细胞中各蛋白表达的半定量测定

讨论

结论

参考文献

综述 转录调节因子DEC1与肿瘤缺氧关系的研究进展

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致谢

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摘要

癌症是世界严重的公共卫生问题，据国际癌症研究机构公布的数据显示，每年全球约有800万人死于癌症。目前我国肿瘤防控面临着严峻挑战，恶性肿瘤已成为居民最大的健康杀手，肿瘤发病率明显增高。每年新发癌症人数280万，死于癌症人数190万。而肝癌死亡率在全国恶性肿瘤死亡率中排在第二位。虽然目前对于肝癌的治疗方案已经日趋完善，但是往往治疗效果较差，目前肝癌的发生发展及其侵袭机制仍未明确，对肝癌发生发展的分子机制研究一直是生命科学以及医学界研究的热点问题。因此对于肝癌发生发展的分子调控网络方面的研究，并从中寻找具有针对性靶向性的干预位点，从而进行定向靶位治疗的方法探索是临床研究的一大挑战。
　　 分化型胚胎软骨发育基因1(Differentiated embryo-chondrocyte expressed gene1，DEC1)在1997年首次发现于人类胚胎软骨组织中。DEC1蛋白属于碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)类转录因子家族，在细胞的增殖与分化、淋巴细胞的成熟、调节分子时钟节律、脂类代谢、细胞的凋亡、缺氧反应、免疫耐受以及肿瘤形成等机体生理功能中发挥重要作用。DEC1蛋白广泛表达于人类大多数正常组织以及多种肿瘤组织中，如非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌，但是在肝癌细胞系中的表达以及缺氧条件下的表达情况仍未明了.
　　 多项研究发现DEC1的表达与缺氧诱导因子-1α(Hypoxia induce factor-1α，HIF-1α)有密切联系，在对乳腺癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、肾癌膀胱癌、胰腺癌的研究中发现，缺氧可以诱导DEC1的高表达，DEC1与HIF-1α的表达具有显著相关性。而在肝癌细胞系中DEC1与HIF-1α的表达情况仍无研究。
　　 增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)是一种仅出现在增殖状态细胞核内的酸性蛋白质，其量的变化与DNA合成一致，具有一定的周期性，检测其在细胞中的表达可作为评价细胞增殖状态的一个指标。Survivin为凋亡抑制基因，是凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis protein，IAP)家族一员，具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤和胚胎组织，且与肿瘤细胞的分化增殖以及浸润转移有着密切关系。我们通过选取PCNA与Survivin作为反应细胞增殖凋亡指标，来初步探讨DEC1在缺氧条件下对原发性肝细胞肝癌的发生发展中的作用。
　　 目的：
　　 本实验以肝癌细胞系Bei-7402、HepG2及正常人肝细胞系QSG-7701为研究对象，探讨正常氧条件及模拟缺氧条件下基因DEC1、HIF-1α、PCNA及Survivin在肝癌细胞系和正常肝细胞系中的表达情况，初步探讨DEC1在原发性肝细胞肝癌发生发展中的作用。
　　 方法：
　　 1.实时荧光定量PCR检测肝癌细胞系Bel-7402、HepG2及正常人肝细胞系QSG-7701中DEC1、HIF-1α、PCNA及Survivin基因mRNA在正常及缺氧条件下的表达情况。
　　 2.应用细胞免疫化学染色的方法检测正常及缺氧24 h条件下肝癌细胞系Bel-7402、HepG2中DEC1、HIF-1α、PCNA及Survivin蛋白的表达定位。
　　 3.以正常人肝细胞系QSG-7701为对照，采用Western Blot方法比较DEC1蛋白在正常人肝细胞与肝癌细胞系中的表达情况。检测缺氧条件下肝癌细胞中DEC1、HIF-1α、PCNA、Survivin蛋白水平的表达。
　　 结果：
　　 1.在正常氧含量条件下，肝癌细胞系Bel-7402、HepG2细胞中DEC1、HIF-1α、PCAN、Survivin基因的mRNA的表达量明显高于正常人肝细胞系QSG-7701。
　　 2.缺氧条件下，肝癌细胞系Bel-7402、HepG2和正常人肝细胞系QSG-7701中DEC1基因mRNA显著高表达。肝癌细胞系Bel-7402、正常人肝细胞系QSG-7701中HIF-1α基因mRNA的表达没有显著性差异;肝癌细胞系HepG2细胞中HIF-1α基因mRNA的表达除6h组没有显著性差异外，3h、12h和24 h均显著高于0h正常对照组。
　　 3.正常人肝细胞系QSG-7701中PCNA基因mRNA的表达变化没有显著性差异;肝癌细胞系Bel-7402中PCNA基因mRNA表达除缺氧24 h组有显著性差异外，其他各组均无显著性差异;而肝癌细胞系HepG2细胞中PCNA基因mRNA的表达除了3h组外，6h、12h、24 h组均显著性增高。肝癌细胞系Bel-7402、HepG2以及正常人肝细胞系QSG-7701中，Survivin基因的mRNA的表达在缺氧培养调件下没有显著性差异。
　　 4.细胞免疫化学染色显示，棕黄色颗粒为阳性颗粒，肝癌细胞系Bel-7402、HepG2中DEC1、HIF-1α蛋白在细胞核和细胞浆中都有表达，而PCNA、Survivin蛋白主要表达于细胞核中。
　　 5.在正常氧含量条件下，肝癌细胞系Bel-7402、HepG2细胞中DEC1蛋白的表达量明显高于正常肝细胞系QSG-7701。在缺氧培养条件下，肝癌细胞系Bel-7402中DEC1、HIF-1α、PCNA蛋白缺氧组的表达显著高于0h正常对照组，Survivin蛋白在缺氧12h后其表达量显著性增高。肝癌细胞系HepG2细胞中HIF-1α、PCNA蛋白缺氧组的表达显著高于0h正常对照组，DEC1、Survivin蛋白在3h、6h、24 h组表达量显著高于0 h正常对照组，而12h组与0h组比没有显著性差异
　　 结论：
　　 缺氧条件下可以通过促使缺氧诱导因子HIF-1α的累积，从而诱导其下游靶基因DEC1蛋白的高表达。DEC1的高表达可能通过与相关信号途径中的靶基因结合调控其表达从而增强肝癌细胞的增殖能力，并在一定程度上抑制肝癌细胞的凋亡。因此DEC1与原发性肝细胞肝癌的发生发展有一定的关系。

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