氯乙烯亚慢性染毒对大鼠肝组织和外周血周期相关microRNAs表达的影响

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目的：
　　检测氯乙烯染毒大鼠肝组织中周期相关 miRNAs（mir-122、mir-125b、mir-192、mir-195、mir-21）表达的改变，探讨其在肝细胞周期改变中的作用；同时检测血清中相应miRNAs的表达，为氯乙烯暴露早期标志物的研究提供依据。
　　方法：
　　1.动物处理：按体重将96只SPF级雄性SD大鼠随机分为三个染毒组（5mg/kg组、25mg/kg组和125mg/kg组）和对照组，每组24只。采用腹腔注射相应体积的氯乙烯气体进行染毒，对照组注射25mg/kg清洁空气,每周3次。分别于染毒第6周、8周、12周末，每组随机选取8只大鼠收集肝组织和血液。
　　2.肝细胞周期检测：新鲜肝组织约100mg制备细胞悬液，用预冷的70％乙醇4℃过夜固定细胞，然后用400μlPI染液暗处染色30min（期间摇晃数次），最后使用流式细胞仪进行检测。
　　3.实时荧光定量PCR：将提取合格的RNA（肝组织提取＜200nt的小片段RNA，血清中提取总RNA）反转录合成cDNA，实时荧光定量（SYBR染料法）检测不同染毒时间各 miRNAs的表达量。获得每个样本的扩增产物Ct值，结果采用2-△△Ct法计算各miRNAs相对于对照组的表达量。
　　4.统计方法：所有数据均使用spss19.0进行整理和分析。对数据进行方差齐性检验；若方差齐，进行单因素方差分析，若方差不齐，进行秩和检验（Kruskal-Wallis H检验）；检验水准为0.05。定量数据如服从正态分布，则以x-±s表示；不服从正态分布，则以中位数和四分位数间距表示。
　　结果：
　　1.大鼠状况：染毒期间，动物状况良好，没有出现明显中毒症状。
　　2.肝细胞周期检测：第6周，125mg/kg组G0/G1期细胞百分比（75.61±9.10%）与对照组（66.83±9.30%）相比增加，且差异有统计学意义（P＜0.05）；第8周，三个剂量组 G0/G1期、S期和G2/M期细胞百分比与对照组相比均无统计学差异（P＞0.05）；第12周，125mg/kg组S期细胞百分比（10.03±3.58%）与对照组（5.79±2.55%）相比增加，且差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　3.肝组织中 miRNAs的表达：5种 miRNAs的相对表达量均呈现出明显的剂量效应和时间效应。随着染毒剂量的增加：第6周，各miRNAs的相对表达量显著上调（P＜0.05）；第8周，mir-125b、mir-21的相对表达量显著下调（P＜0.05）；第12周，各 miRNAs的相对表达量显著下调（P＜0.05）。随着时间的延长：对照组和5mg/kg组，各miRNAs的相对表达量差异无显著性（P＞0.05）；25mg/kg组和125mg/kg组，各miRNAs的相对表达量显著下调（P＜0.05），且125mg/kg组下调更明显，但25mg/kg组mir-195的相对表达量各时间点差异无显著性（P＞0.05）。从染毒第8周开始，各miRNAs在25mg/kg组和125mg/kg组的相对表达量均低于对照组(5mg/kg组与对照组相比表达略增高，但差异无统计学意义)，且随着剂量的增加和时间的延长下调更加明显。
　　4.血清中miRNAs的表达：mir-122、mir-125b、mir-21的相对表达量均不显示显著的剂量效应和时间效应。mir-192相对表达量有显著的时间效应（P＜0.05），表现为先增加后降低，但两两比较无统计学差异；mir-195相对表达量有显著的时间效应（P＜0.05），表现为先降低后增加，但两两比较无统计学差异。
　　5.肝组织和血清中miRNAs相关性分析：进行肝组织和血清中表达的相关性分析，5种miRNAs均未发现有显著相关性（P＞0.05）。
　　结论：
　　1.氯乙烯破坏肝细胞G1/S关卡，使肝细胞短时间停滞于G1期，随着时间的延长，细胞进入S期的比例增加。
　　2.氯乙烯染毒6周，大鼠肝组织 miRNAs（mir-122、mir-125b、mir-192、mir-195、mir-21）表达上调，从第8周开始下调，并且到第12周时下调更加显著。
　　3.肝组织miRNAs（mir-122、mir-125b、mir-192、mir-195、mir-21）表达量的变化可能与肝细胞周期G1/S关卡调控有关。
　　4.低丰度的miRNAs可能在氯乙烯致肝损伤中发挥重要作用。
　　5.在肝组织与血清中，miRNAs（mir-122、mir-125b、mir-192、mir-195和mir-21）表达量的变化不同。
　　6.血清mir-192和mir-195可否作为氯乙烯早期暴露的标志物，还需要进一步研究证实。

著录项

作者
梁洁;
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作者单位

山西医科大学;

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授予单位山西医科大学;
学科卫生毒理学
授予学位硕士
导师姓名仇玉兰;
年度 2016
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类卫生毒理;
关键词
氯乙烯; 细胞周期; 慢性染毒; 肝组织; microRNAs表达;

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