急性T淋巴细胞白血病患者PCR-SSCP检测Notch1基因突变及与LIM蛋白FHL1C相关性研究

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白血病是一类特殊的造血系统恶性肿瘤，其发病原因是因为抑癌基因被失活，致癌基因的激活，单独或共同作用从而使细胞出现非正常的增殖现象与分化障碍，或凋亡机制受到干扰所引起。T-cell acute lymphoblastic leukemia即 T淋巴细胞急性白血病（T-ALL)是白血病里一种高侵袭性恶性肿瘤，特征以T细胞克隆增生、聚集及浸润组织为特征，其起源于T淋巴细胞的初期发育阶段，属于血液系统恶性肿瘤，其病程为进行性，该疾病在儿童中的发病率远高于成人。目前，联合化疗仍是该种疾病的首选治疗途径，但治疗后患者再次出现发病的比例超过50％，平均生存时间（Mean survival time）短于1年，达到EFS(Event-free survival，无事件生存)标准的比例在异基因造血干细胞移植后仅为30%～50%，对于成人患者来说，T-ALL疗效尤为不佳，急需治疗措施的进步。因此，对T-ALL这一恶性肿瘤的发病机制、治疗手段的深入研究和探索对于改善T-ALL患者的预后，提高长期生存率具有重要意义。
　　最先在人类T-ALL中发现了Notch信号通路可影响到恶性肿瘤发病机制，近年来相关研究显示约50％T-ALL患者可存在Notc h1基因的突变，No tc h1基因已成为急性T淋巴细胞白血病发病机制中最为常见的活跃癌基因。有资料显示，T-ALL发生及发展的主要机制是人类基因组中7号染色体上和9号染色体上的基因发生了易位（分别是TCR基因和No tc h1基因），No tc h基因组序列出现点突变后可引起Notc h信号非正常激活。还有证据显示，因染色体易位或点突变现象发生在Notc h基因均可导致 Notch信号传导途径相关组成部分内重要的胞内受体段(Notch intracellular domain，NIC)可呈现出不间断的不依靠配体而出现活化的相关现象，这一异常机制可引起超过50%的T-ALL患者细胞内Notc h1信号通路出现异常活化现象。
　　在哺乳动物的 Notch信号通路中，起转录激活作用的 RBP-J蛋白是以转录因子的形式发挥生理功能的，其功能属于DNA结合蛋白。Aster研究组发现RBP-J作为Notch信号通路其中的关键转录因子是作为与No tc h1突变异构体主要的互相结合蛋白，形成复合物后可调控信号传导途径下游里与T-ALL发生可能相关的一系列基因的表达。
　　在小鼠体内发现一种LIM结构域蛋白KyoT2，可与NIC竞争结合RBP-J而抑制RBP-J介导的转录，已知属于FHL1家族的FHL1C是人类体内的小鼠KyoT2分子同源蛋白。近年来通过免疫组化分析和microarray谱比较临床患者中提取的肿瘤标本，发现 FHL1在如恶性脑肿瘤、结肠癌、肺癌和乳腺癌等多种肿瘤组织中都呈现低表达，而在T-ALL患者中FHL1C（FHL1的选择性剪切体亚型之一）呈现低表达状态。本研究组既往的研究成果证实FHL1C亦可抑制RBP-J介导的Notch信号通路的转录，其具体原理是上述现象抑制了与T-ALL发生有密切关系的 Notch信号通路下游C-Myc、HES1和HES5分子的表达，同时促进相关凋亡基因的表达。上述资料提示：对T-ALL患者同时检测Notch1和FHL1C的基因突变情况有助于快速诊断T-ALL患者的病情状况和预测其预后发展。基于验证此设想，我们进行了如下实验。
　　主要研究结果：
　　1、通过收集T-ALL患者和对照组的骨髓及静脉血样本，分离骨髓及静脉血淋巴细胞并提取其全基因组，设计引物通过PCR和巢式PCR（nes ted PCR）技术克隆出相关片段。按照要求构建实验组和对照组，并用SSCP技术对Notch1和FHL1C可能发生突变位点位置的系列片段进行检测，并对比测序结果，发现其检验效率达到95%以上。
　　2、在此结果基础上通过统计学方法分别分析了Notch1、FHL1C有效突变结果对患者的病情造成的影响，证实Notch1有效突变对T-ALL患者的预后影响有统计学意义，FHL1C有效突变对患者预后影响无统计学意义，但二者存在交互作用，提示FHL1C有效突变可影响Notch1有效突变对T-ALL患者的预后作用。
　　3、成功构建了表达FHL1C的真核表达载体FHL1C-pEGFP-N1，通过核酸转染Hela细胞、Wester n-blot验证表达蛋白、流式细胞术检测产生的荧光蛋白，证明了所构建的真核表达载体的正确性，为进一步研究FHL1C分子两端区域的不同功能做好了前期准备工作。
　　以上研究结果显示，通过PCR-SSCP技术对T-ALL患者基因突变位点进行诊断，相比较传统测序技术，在同样保持准确率的基础上还具有简便快速，性价比高的优点，更能适应临床工作需求；检测Notch1、FHL1C有效突变结果并结合分析可以对T-ALL患者病情发展预测提供一定参考价值，从而有更多的治疗选择。

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作者
王凯;
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作者单位

第四军医大学;

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授予单位第四军医大学;
学科临床医学
授予学位博士
导师姓名梁英民;
年度 2014
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正文语种中文
中图分类急性白血病;
关键词
信号通路; 急性T淋巴细胞白血病; 发病机制; 平均生存时间;

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