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白藜芦醇诱导恶性胶质瘤细胞凋亡并增强替莫唑胺药物敏感性作用的分子机制

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文献回顾

一、恶性胶质瘤的临床治疗

二、替莫唑胺化疗的研究进展

三、MGMT表达的调控机制

四、MGMT靶向性辅助化疗药物

五、白藜芦醇的研究概况

正文

实验一 白藜芦醇诱导恶性胶质瘤细胞凋亡的分子机制研究

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

实验二 白藜芦醇增强恶性胶质瘤细胞对替莫唑胺药物敏感性作用的分子机制

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢

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摘要

恶性胶质瘤（WHOIV）是最常见的颅内恶性肿瘤，占颅内肿瘤的40-50％。尽管恶性胶质瘤的发病率（3/100,000）不及大多数其它系统的肿瘤，但是因为它迅速生长和侵袭瘤周重要的生命调控中枢以及对目前各项治疗方案的不敏感性，其预后远远差于其它系统的肿瘤。恶性胶质瘤具有病程短和死亡率高的特点。目前包括影像导航的神经外科手术、立体定向放疗和以细胞毒药物为基础的化疗都不能在根本上治愈该类疾病。恶性胶质瘤病人通常在初次手术后不足一年时间内复发或死亡。仅接受次全切手术治疗的恶性胶质瘤病人的平均生存时间仅7.0个月，接受次全切手术治疗和放射治疗的恶性胶质瘤病人的平均生存时间仅12.1个月。虽然目前得到广泛认可的替莫唑胺化疗能有效地延长病人的生存时间、增强病人的生存质量，但是因为恶性胶质瘤内MGMT系统的活跃作用，大约48％-58％的病人对替莫唑胺化疗并不敏感。这些病人不得不寻求诸如顺铂等其它药物的治疗，但是疗效明显不如替莫唑胺(平均生存时间15个月vs.25.5个月)。研发最新的替莫唑胺的辅助化疗药物以增强恶性胶质瘤病人对替莫唑胺药物的敏感性、扩大适应人群以及提高替莫唑胺的疗效，无疑具有重要的临床意义。
　　白藜芦醇是一种天然的、具有抗肿瘤活性的多酚类化合物。既往研究表明它还具有抑制动脉粥样硬化以及保护神经细胞等多种潜能。在以前的研究里我们发现白藜芦醇能够显著地抑制恶性胶质瘤细胞的生长、增殖、并诱导瘤细胞发生caspase依赖性的凋亡。白藜芦醇诱导的细胞凋亡与YKL-40的表达抑制和ERK-1/2的磷酸化有关。此外，白藜芦醇参与了多种生化活动的调节，例如下调HIF-1α、VEGF和NF-kappaB的表达、上调抑癌基因p53的表达以及抑制STAT3的活化等等。鉴于NF-kappaB是耐药基因MGMT的重要的正性转录调控因子而p53是MGMT最重要的负性转录调控因子，我们期望白藜芦醇能够通过抑制NF-kappaB和增加p53表达藉以下调MGMT的表达，从而增强恶性胶质瘤病人对替莫唑胺药物的敏感性。为了明确白藜芦醇与替莫唑胺的联合处理是否能够发挥更强的抗恶性胶质瘤活性，我们设计并开展了一系列实验研究。
　　我们在恶性胶质瘤A172和T98G细胞中首次证实了白藜芦醇对恶性胶质瘤的抗肿瘤活性。这两种细胞具有Notch-1和p53低活性的基因特征。结果表明，白藜芦醇能够以时间和剂量依赖的方式显著地抑制A172和T98G的细胞活力并诱导恶性胶质瘤细胞凋亡。在凋亡过程中，我们观察到白藜芦醇显著地促进了Notch-1的活化，增强了瘤细胞内野生型p53的表达及核转位。此外，白藜芦醇还导致了瘤细胞内Akt-1的去磷酸化、上调了促凋亡蛋白Bax的表达、下调了促生存蛋白Bcl-2的表达、最终活化了由caspase-3介导的酶解级联反应。Notch-1信号是神经发育和肿瘤演进的重要调控因子，为了明确Notch-1的活化是否在白藜芦醇诱导的肿瘤细胞凋亡中起到关键作用，我们用Notch-1抑制剂MRK-003与白藜芦醇联合处理了A172和T98G细胞。实验观察到，MRK-003能够完全阻断由白藜芦醇导致的Notch-1信号的活化，并且在一定程度上削弱了细胞凋亡的发生。与此同时，我们还发现白藜芦醇对p53的上调表达和促进核转位的能力也被显著减弱。而且，下游的一系列凋亡信号通路蛋白的变化幅度也不如白藜芦醇单独处理时明显。这说明，Notch-1活化依赖性的p53表达和核转位是白藜芦醇诱导的恶性胶质瘤A172和T98G细胞发生凋亡的重要分子机制之一。
　　在预实验里，我们检测了多株恶性胶质瘤细胞中MGMT的表达水平。结果表明，目前本实验室传代的这些恶性胶质瘤细胞系中只有T98G细胞中MGMT呈阳性表达并且对替莫唑胺药物敏感性低。我们随即检测了白藜芦醇与替莫唑胺联合处理对恶性胶质瘤T98G细胞的影响。研究发现，根据临床剂量换算的100μM替莫唑胺单独处理T98G细胞24小时不能诱导大部分瘤细胞发生凋亡，而白藜芦醇与替莫唑胺联合处理则能显著地增强替莫唑胺对瘤细胞的细胞生长抑制作用（98.2±1.1％vs.61.4±4.5％，p=0.001）和诱导凋亡作用（11.5±2.3％vs.42.5±1.8％，p=0.001）。实验表明，白藜芦醇能够增加恶性胶质瘤T98G细胞对替莫唑胺的药物敏感性，二者的联合处理具有协同作用。考虑到T98G细胞对替莫唑胺药物的不敏感性源自肿瘤细胞内表达的MGMT蛋白，我们开展了蛋白电泳实验检测了药物处理前后瘤细胞内MGMT的表达水平。结果发现，替莫唑胺单独处理能显著诱导瘤细胞内MGMT蛋白的表达（149.6±8.3％，p=0.001），而白藜芦醇的联合应用能几乎完全抑制由替莫唑胺诱导的MGMT表达，将之降低到相当微弱的水平（p=0.001）。由此可见，白藜芦醇则能够完全阻断瘤细胞内MGMT的生成，这可能是除增强凋亡诱导能力之外白藜芦醇增加恶性胶质瘤对替莫唑胺药物敏感性的重要原因。鉴于NF-kappaB是MGMT最重要的正性转录调控因子，我们继而又检测了药物处理后瘤细胞内NF-kappaB信号通路蛋白的表达变化。kappaB-ras1和I-kappa-B-α是NF-kappaB最重要的两个抑制因子。蛋白电泳结果表明，白藜芦醇和替莫唑胺的联合处理不能恢复瘤细胞内kappaB-ras1的表达，也不改变I-kappa-B-α的表达水平（105.5±7.6％，p=0.07）。替莫唑胺单独处理能诱导瘤细胞内NF-kappaBp65亚基的表达（109.2±2.8％，p=0.03），而白藜芦醇和替莫唑胺的联合处理则能够显著地下调瘤细胞内NF-kappaBp65亚基的表达水平（74.6±3.5％，p=0.001）。
　　根据这些研究结果，我们认为，恶性胶质瘤T98G细胞对替莫唑胺药物的不敏感性一方面是因为瘤细胞内MGMT蛋白的内生性表达；另一方面也是因为替莫唑胺还能通过上调NF-kappaB表达来诱导瘤细胞生成更多的MGMT。而白藜芦醇则能够通过活化的Notch-1信号：（1）促进p53蛋白的表达和核转位；（2）抑制NF-kappaBp65亚基的表达；（3）阻断瘤细胞内MGMT的表达，藉以增加恶性胶质瘤细胞对替莫唑胺的药物敏感性，使更多的瘤细胞发生凋亡。我们的研究表明，白藜芦醇与替莫唑胺的联合应用具有协同作用，能够增加恶性胶质瘤细胞对替莫唑胺的药物敏感性。因此，白藜芦醇是一种可靠的替莫唑胺的辅助化疗药物，有关它的更多作用，尚待深入研究。

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