细胞因子诱导人骨髓基质细胞向神经细胞分化的实验研究

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本研究应用改良的全骨髓培养法分离培养骨髓基质细胞，研究其生物学特征，采用细胞因子维甲酸和碱性成纤维生长因子、脑源性神经营养因子的不同组合方案诱导骨髓基质细胞向神经细胞分化，并进一步研究在干细胞分化的不同阶段加入细胞因子BDNF对干细胞分化的影响，探究骨髓基质细胞向神经细胞定向诱导分化的最佳方法，为神经组织工程细胞移植应用于临床提供实验资料和基础。实验第一部分：利用改良的全骨髓培养法分离培养人骨髓基质细胞，研究并记录其生长特性和生物学特点；系统地研究比较了目前最为常用的几种分离培养方法，观察不同分离方法对人骨髓基质细胞增殖及生物学特性的影响；采用含不同二甲亚砜浓度的保存液以及不同的细胞浓度，在一2196℃下对细胞进行冷冻保存，检测细胞存活率，比较冻存对人骨髓基质细胞生物学行为的影响，力求筛选出合适的冻存条件和方法，为组织工程提供足量、高质的种子细胞。结果证实： 1.本实验采用的改良的全骨髓分离培养法，方法简便，实验成本低，原代培养成功率达100％，细胞生长稳定，增殖速度快，贴壁率高，保持了干细胞的形态特点，证明了本实验方法可以稳定获取和扩增人骨髓基质细胞，在组织工程的种子细胞培养中有较大的应用价值。 2.bFGF促进人骨髓基质细胞的增殖并呈剂量依赖性：在10～30ng/ml范围内，促增殖效果较好，浓度在20ng/ml水平促增殖作用最好。人骨髓基质细胞超微结构的透射电镜观察，镜下可见细胞质内粗面内质网、线粒体及糖原丰富，相邻细胞间存在起信号传递作用的缝隙连接，说明了培养分离的人骨髓基质细胞功能活跃，具有较强的蛋白质合成能力和增殖能力，具备了干细胞的特性。 3.不同的分离方法比较实验中发现：本实验选用的改良的全骨髓培养法分离培养效果较好，既保留了血液中的多种细胞及营养因子，能够促进BMSC的生长，同时又避免了诸如需高速离心、多次半量换液、观察时间长、杂类细胞接触抑制等问题；溶血分离法只适于很少的来源于低龄献髓者的样本；流式细胞分离法和磁珠分离法的应用因操作繁琐、成本较高、对细胞的活性影响较大而受到限制；密度梯度离心法虽分离效果较好，但与离心速度直接相关，高速离心对细胞损伤较大，不利于后期细胞生长。 4.为避免出现骨髓液凝结现象，本实验中尝试加大肝素抗凝剂量到250U/ml，发现抗凝效果良好，而且分离后的细胞活性较好。通过2次应用培养液对分离细胞的洗涤，可以避免大剂量的肝素对细胞的毒性作用。 5.在不同DMSO浓度的冻存液对人骨髓基质细胞长期冻存影响的实验中，发现10％DMSO组保存效果最佳，对长期保存骨髓基质细胞较为适宜，该组冻存2个月后再接种培养的骨髓基质细胞的生长、体外诱导分化能力与未冻存骨髓基质细胞相似，且优于15％和20％DMSO组。 6.对不同细胞浓度的人骨髓基质细胞进行冻存后发现，高细胞浓度组的保存效果优于低细胞浓度组，当细胞浓度为每毫升1×106个细胞时，复苏后细胞的存活率下降；细胞浓度高于每毫升1×107个细胞时，细胞的活力有所增加，说明冻存时细胞浓度对细胞冻存有一定的影响，浓度太低，复苏后细胞活力下降。实验第二部分:人骨髓基质细胞向神经细胞的诱导分化研究。实验中选用传5代纯化的人骨髓基质细胞为实验对象，应用细胞因子RA、bFGF和BDNF的不同组合方案诱导骨髓基质细胞向神经细胞分化，并进一步研究在干细胞分化的不同阶段加入细胞因子BDNF对干细胞分化的影响，结果证实： 1.RA+bFGF+BDNF组诱导效果最好，神经元细胞阳性率达48.5％±0.2％，且细胞存活时间较长。通过实验证实：RA能促进体外培养的人骨髓基质细胞向神经元样细胞分化；bFGF可促进诱导后的神经样细胞的增殖和存活；BDNF能够促进RA诱导作用，提高RA诱导的神经元细胞分化比率。 2.在BDNF时序实验中，经RA+bFGF诱导3～7d后加入BDNF，诱导效果较好，最终神经元分化比率较高，BDNF具有促进诱导后神经元样细胞成熟的作用。本实验建立了一套既可以稳定获取和扩增人骨髓基质细胞，又具有实验成本低，操作简便、快速、实用、对细胞活性影响小等优点的比较理想的分离、纯化及细胞冻存方法，应用RA等细胞因子在体外可成功的将人骨髓基质细胞诱导为神经细胞。

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作者
胡学昱;
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作者单位

第四军医大学;

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授予单位第四军医大学;
学科外科学(骨外)
授予学位硕士
导师姓名罗卓荆;
年度 2006
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R687.34;
关键词
脊髓损伤; 细胞因子诱导; 骨髓基质细; 神经细胞;

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