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衰老肠道微生态的变化及干预措施研究

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缩略词表

前言

1立项背景及国内外研究现状

2 拟解决的科学问题

3推进科学研究和军事医学发展等方面的理论意义与实用价值

4研究思路和研究方法

第一部分：衰老人群肠道菌群的变化

引言

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二部分：支链氨基酸对衰老小鼠肠道微生态的干预研究

引言

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 结论

总结

参考文献

附表

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摘要

随着经济技术的发展和人民生活水平的提高，我国已经提前进入了人口老龄化社会，很多老年相关疾病和老年人的健康状况得到了大家的关注。肠道微生态是指肠道菌群的组成，结构，功能以及它们与宿主之间的相互作用，它在人体健康和一些疾病的发生发展过程中都有重要的作用。随着二代测序技术和各类组学的发展，研究人员对肠道微生态的了解也越来越多，在机体的整个生命过程中，肠道微生态并非一成不变的，它会受到生理状况，生活习惯等多方面的影响，在衰老之后由于各种生理原因，肠道微生态会发生一定变化，所以肠道微生态具有很大的可塑性，很有可能成为我们改善老年健康状况，预防老年相关疾病的作用靶标。
　　世界上已经有一些关于衰老肠道菌群的研究，但是这些研究涉及到不同的国家和地区，且研究样本的数量和年龄各有不同，采用的研究方法也不尽相同，所以得出的结论并不统一，对于衰老之后肠道菌群的变化规律并无定论，另外在这些研究中并没有我国衰老肠道菌群的大样本研究。所以本文的主要研究目的是研究我国衰老人群的肠道菌群变化，进而用小鼠作为模型，研究改善衰老肠道微生态的方法。
　　为了研究衰老人群肠道菌群的变化，我们在我国河南省采集了102份粪便标本，其中包括59名老年人（男29,女30），平均年龄为77.6岁；15名中年人（男10,女5），平均年龄为48岁；还有28名年轻人（男18,女10），平均年龄为32岁。利用16s高通量测序的方法检测其肠道菌群，在菌门水平下，3组人群中，拟杆菌门和厚壁菌门均为最主要的两个菌门，占据整体菌群的80％以上，其中又以拟杆菌门含量最多，在老年组中，拟杆菌门为52.4%,厚壁菌门为27.9%；在中年组中拟杆菌门为55.2%,厚壁菌门为31.7%；在年轻人组中，拟杆菌门为49.2%,厚壁菌门为36.2%。变形菌门含量仅次于上述两大菌门，在老年组、中年组和年轻人组中分别为17.7%、11.1%和12.0%。以上菌门的组成与已有数据报道的国家相比，都有不同之处。衰老之后的肠道菌群变化趋势为拟杆菌门的含量随着年龄的增长逐渐增多，厚壁菌门含量降低，厚壁菌门/拟杆菌门的比值在年轻人组、中年组和老年组中分别为0.73、0.57和0.53，逐渐降低，更能直观地反映这种变化趋势。在整体的菌群结构中，我们采用了Beta多样性分析中的PCoA分析和NMDS分析来显示衰老肠道菌群的变化，在这两个分析中都显示，代表老年组和年轻人组的点距离较远，说明它们之间的整体菌群组成差别较大， 老年组之中，样本与样本之间离散度较高，而年轻人组中标本之间距离较近，比较集中，说明老年组组间差异较大，而年轻人组组间差异较小。为了进一步探讨具体菌属的差异，我们又进行了组间显著性差异metastats分析，分析发现产丁酸盐的细菌在老年人组及年轻人组之中含量差别较大，Faecalibacterium菌属和Roseburia菌属在老年组中显著低于年轻人组，产乙酸和乳酸的Gemella菌属和产丙酸的Propionibacterium菌属也在老年组中降低。但以往认为在老年人中会降低的双歧杆菌（Bifidobacterium）菌属，在我们的研究中老年组和年轻组中并没有明显差异，另外Akkermansia菌属在老年组中的含量要高于年轻人组，这种菌属与人类机体的代谢及相关健康状况有关。
　　在用BALB/c小鼠作为模型研究衰老肠道微生态的干预措施时，我们选取了富含支链氨基酸的氨基酸混合物（BCAAem）作为干预措施，分别研究了其对衰老小鼠肠道菌群，粪便上清代谢组学及机体免疫状况的影响。干预的时间为小鼠11月龄到15月龄，即相当于从中年期到老年期，在衰老小鼠肠道菌群的研究中， BCAAem喂养组肠道菌群的丰富度高于对照组，且BCAAem喂养组在整体的菌群结构上也与对照组不同。小鼠的肠道菌群仍然以拟杆菌门和厚壁菌门为主，两者占据了全部菌群的95%以上，其中拟杆菌门为含量最高的菌门，均在50%以上，而厚壁菌门约为45%左右。在11月龄时，对照组拟杆菌门含量为51.37%，BCAAem喂养组为51.68%，对照组厚壁菌门为46.24%，BCAAem喂养组为44.91%；而在15月龄时，对照组拟杆菌门含量为59.64%，BCAAem喂养组为55.85%，对照组厚壁菌门为38.16%，BCAAem喂养组为41.78%。随着年龄的增长小鼠的拟杆菌门含量逐渐增多，而厚壁菌门的含量逐渐降低，与我们所做人体的肠道菌群变化趋势类似。在对照组中，随着年龄的增长，拟杆菌门的含量增长了8.27%，而厚壁菌门下降了8.08%；在BCAAem喂养组中，拟杆菌门的含量增长了4.17%，而厚壁菌门下降了3.13%。BCAAem的喂养延缓了肠道菌群由于年龄而变化的趋势，这一趋势可以在厚壁菌门/拟杆菌门的比值中观察的更清楚，在对照组中，厚壁菌门/拟杆菌门的比值在11月龄时为0.90，而在15月龄时为0.64；在BCAAem喂养组中，厚壁菌门/拟杆菌门的比值在11月龄时为0.87，而在15月龄时为0.75。变形菌门为含量第三大的菌门，在15月龄时，对照组的变形菌门含量显著高于BCAAem喂养组，约为后者的两倍，变形菌门中含有一些致病菌，如肠杆菌，这些肠杆菌可以在特定的环境中导致感染而致病，说明BCAAem的喂养可以降低肠道中变形菌门的含量，从而能起到一定的改善肠道健康的作用。为了验证16s高通量测序的准确性和检测含量极低的细菌，我们对Bifidobacterium，Lactobacillus，Clostridium leptum和Prevotella这四类细菌进行了荧光定量PCR的检测，Bifidobacterium无论是在对照组还是BCAAem喂养组， 随着年龄的增长，其含量都呈现出一个降低的趋势，但是在BCAAem喂养组中，Bifidobacterium降低的趋势比较平缓，且在14月龄和15月龄时Bifidobacterium的含量要高于对照组，说明喂养BCAAem后，可以增加肠道内Bifidobacterium的含量。Lactobacillus和Prevotella菌属在两组之间差异不大，Clostridium leptum在对照组和BCAAem喂养组，随着年龄的增长，其含量都有一定的增加，其中在BCAAem喂养组中增加的量较多，而且对比15月龄时的数据发现，BCAAem喂养组要高于对照组。
　　在对机体肠道的免疫状况进行研究时，我们检测了小鼠粪便上清中的两种促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β，以及一种抗炎性细胞因子IL-10。结果显示在15月龄时，对照组的TNF-α浓度平均值为57.6pg/ml，而BCAAem喂养组的平均值为46.1pg/ml；对照组IL-1β的浓度平均值为182.0pg/ml，而在BCAAem喂养组中浓度的平均值为158.3pg/ml，TNF-α和IL-1β在BCAAem喂养组中浓度低于对照组。而IL-10在15月龄对照组中的浓度平均值为34.6pg/ml，在BCAAem喂养组中浓度的平均值为96.2 pg/ml，BCAAem喂养组高于对照组。另外我们还检测了可以反映机体免疫负载的脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP），在小鼠15月龄时，BCAAem喂养组中，LBP的含量为20.3pg/ml，而对照组为39.7pg/ml，BCAAem喂养组LBP的浓度是明显低于对照组的。以上结果均说明BCAAem的喂养可以降低肠道的炎症反应和免疫抗原的负载，从而改善整个机体的免疫状况。
　　在粪便上清代谢组学的研究中，我们发现BCAAem喂养组和对照组在代谢产物的组成上有明显差异，差异代谢物有十八碳烯酸，胆固醇，油酸，脱氧胆酸，丙三醇，果糖，蔗糖，赤藻糖醇，油酸甘油酯，木糖醇，苯乳酸，豆甾醇。其中在BCAAem喂养组中相对升高的是十八碳烯酸，胆固醇，油酸，脱氧胆酸，丙三醇，而相对降低的是果糖，蔗糖，赤藻糖醇，油酸甘油酯，木糖醇，苯乳酸，豆甾醇，两组中差别较大的多是与脂类代谢和糖代谢相关的代谢产物。所以，BCAAem的喂养使整个粪便的代谢物组成发生了变化，而其中脂类代谢和糖代谢是变化较多的部分，这些差异物为深入研究BCAAem的喂养对肠道代谢造成的影响奠定基础。
　　综上所述，本课题首次大样本研究了我国衰老人群肠道菌群的变化，整体结构和菌群各分类水平均与年轻人有不同之处。又利用小鼠模型首次探讨了BCAAem这一干预措施对衰老肠道微生态的作用，BCAAem可以延缓小鼠肠道菌群由于年龄而产生的变化，改变小鼠肠道代谢，改善肠道的免疫状况，可以起到一定改善衰老肠道微生态的作用。

著录项

  • 作者

    杨展;

  • 作者单位

    解放军军事医学科学院;

    中国人民解放军军事医学科学院;

  • 授予单位 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院;
  • 学科 军事预防医学
  • 授予学位 博士
  • 导师姓名 黄留玉;
  • 年度 2017
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 R339.38;
  • 关键词

    衰老; 肠道微生态; 支链氨基酸; 代谢组学; 免疫抗原;

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