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血凝素受体结合域E190G、K193E和G225E突变对H5N1禽流感病毒受体结合特异性和致病性影响的研究

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第一部分 H5N1禽流感病毒RBD突变株的分离、鉴定与重组病毒拯救

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分 RBD突变对H5N1禽流感病毒受体结合特异性的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三部分 RBD突变病毒的体外复制动力学研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第四部分 RBD突变病毒对小鼠致病性的研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

综述

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摘要

H5N1流感病毒是甲型流感病毒的一个高致病亚型，它是一种可以通过家禽传染给人类的高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)，可以导致人和其他一些动物死亡。H5N1病毒于1996年首次在中国广东家鹅体内被发现，1997年8月，香港报告了全球首个感染H5N1禽流感病毒死亡病例。该型病毒近几年有不断扩散的趋势，在世界卫生组织(WHO)已确认的感染病例中，H5N1高致病性禽流感病毒对人类的致死率约为58％。目前对H5N1病毒致病机制的研究主要集中于PB2、PB1、PA和NS1等基因。血凝素蛋白(hemagglutinin，HA)的受体结合域(receptor binding domain，RBD)突变对于病毒致病性的影响尚不明确。
　　在流感病毒表面分布大量的HA，它是流感病毒的主要包膜糖蛋白之一，RBD位于HA球状头部顶端，它的主要功能是识别宿主细胞表面的唾液酸并与之结合，实现病毒对宿主细胞的入侵感染。本研究分析了H5N1禽流感病毒在体外和体内传代后在RBD的突变位点，分离并鉴定RBD突变:K193E、G225E和E190G。为了鉴定突变位点对H5N1病毒属性的影响，本研究以临床分离的A/Vietnam/1194/2004(VN1194)株为模式株，拯救了含有突变RBD的重组病毒并对拯救病毒进行了病毒学性状鉴定。
　　一、VN1194病毒RBD突变位点的分离鉴定与重组拯救
　　本研究首先通过人为改变病毒增殖环境，诱导H5N1禽流感病毒产生环境适应性突变，筛选其中的RBD突变病毒并对其进行研究。我们以A/Vietnam/1194/2004(H5N1，VN1194)病毒为模式株，在不同环境中增殖，包括低温(33℃)体外感染MDCK细胞后连续传代;在BALB/c小鼠体内增殖后分离鼠肺中病毒。对两种适应性病毒测序后发现，在PB2、PB1、HA和NA片段均存在突变，其中HA片段中的突变K193E、G225和E190G均位于RBD关键位置且相关报道很少。通过病毒蛋白结构同源数据库预测和结构模拟发现，190、193和225位点均位于RBD结构的核心组成部分-190螺旋和220环，且位于浅口状结构外周。
　　为了鉴定突变位点对流感病毒性状的影响，利用融合PCR对HA定点突变，获得含有所有突变组合的HA片段，利用反向遗传学技术和pHW2000双向转录质粒拯救重组突变病毒并鉴定，成功拯救获得重组病毒rVN1194（野生型重组突变病毒）、rVN-E190G、rVN-K193E、rVN-G225E和rVN-K193E/G225E。与E190G突变组合的双突变、三突变病毒并不能拯救获得感染性病毒颗粒，说明190突变并不能与193、225突变共存，故将E190G单独评价。重组病毒在MDCK细胞中连续传8代后，RBD突变能够稳定遗传，未发生突变恢复。
　　二、RBD突变（E190G、K193E和G225E）对病毒受体结合特异性的影响
　　为了确认RBD突变对病毒受体结合特异性的影响，首先利用PEG-6000对病毒浓缩和离心纯化，再通过鸡血红细胞血凝检测对重组病毒HA定量，然后进行固相受体结合检测。实验结果表明，(1)体外低温适应型RBD突变K193E对病毒受体结合特异性影响不显著，G225E能够显著增强病毒对α-2，3型唾液酸受体亲和力，而K193E/G225E双突变对病毒受体结合无影响，其亲和力与野生型接近。(2)鼠肺适应型RBD突变E190G能显著降低病毒对α-2，3型受体的结合力，略微增加对α-2，6型受体的亲和力。但所有突变均不能使VN1194病毒受体嗜性由α-2，3型转变为α-2，6型。
　　三、RBD突变（E190G、K193E和G225E）对病毒体外复制能力的影响
　　为了深入研究RBD突变位点对病毒体外复制能力的影响，本研究选取不同细胞系测定重组病毒在不同温度下体外复制动力学特征。用重组突变病毒分别体外感染MDCK与A549细胞，通过蚀斑实验测定细胞感染后上清中病毒滴度，绘制病毒在33℃、37℃和39℃的增殖曲线。复制动力学实验证明体外低温适应型RBD突变K193E和G225E单突变对病毒体外增殖影响较小，其复制能力与野生型近似。但K193E/G225E双突变能够显著增强病毒体外复制能力，增强效果不随温度改变而变化。鼠肺适应型突变E190G可相对减弱病毒体外增殖，但减毒效果弱于K193E/G225E双突变株。
　　四、RBD突变（E190G、K193E和G225E）对病毒毒力的影响
　　本研究利用BALB/c小鼠动物模型，通过滴鼻感染测定重组突变病毒与野生型病毒的MLD50值、小鼠体重变化和鼠肺病毒载量测定RBD突变对病毒毒力的影响。动物实验证明，rVN-K193E和rVN-G225E病毒在小鼠体内毒力均减弱，但减毒效果均弱于双突变株。rVN-K193E/G225E病毒对小鼠的致病性显著下降，其MLD50值远大于1000 PFU，而野生型病毒MLD50值仅为2.65 PFU。rVN-E190G病毒在小鼠体内毒力也低于野生型病毒。
　　为了验证减毒株病毒诱导小鼠产生的抗体对野生型H5N1病毒的中和效果，将rVN-K193E/G225E病毒灭活后添加弗氏佐剂，皮下接种BALB/c小鼠，于第一周与第三周两次免疫，刺激小鼠产生保护性抗体。通过微量抗体中和试验，我们发现rVN-K193E/G225E病毒免疫小鼠后产生的抗体可以有效中和VN1194野生型病毒，证明K193E/G225E突变并不影响病毒刺激机体产生抗野生型病毒中和抗体。接着我们使用突变病毒刺激小鼠淋巴细胞(RAW264.7)，测定细胞上清中IL-6、IFNγ、TNFα和IP10的表达水平。实验证明，突变病毒同样能够刺激小鼠免疫细胞产生TNFα和IP10因子，且与感染野生型VN1194水平相同。
　　本研究首次证明了RBD突变位点193、225和190与H5N1禽流感病毒致病性之间的关系，揭示了体外低温适应型RBD突变K193E、G225E和鼠肺适应型突变E190G对VN1194病毒体外复制能力、小鼠体内毒力的影响。本研究结果拓展了对H5N1流感病毒致病分子基础的认识，加深了对RBD功能的了解。
　　rVN-K193E/G225E重组突变病毒的各项病毒学特性的变化证明RBD双突变K193E/G225E能显著减弱H5N1禽流感病毒的毒力，且体外复制能力不降低。实验证明，该突变株在体外传代稳定，未发现突变恢复现象。该基因位点突变为筛选H5N1病毒的稳定减毒株可提供一定的理论指导，为新型H5N1减毒活疫苗研发提供一种新策略。该基因位点突变病毒可以作为实验室低毒模式株，对H5N1流感病毒进行RBD之外的其他基因结构、功能等研究，从而降低实验室研究的安全风险。

著录项

  • 作者

    韩鹏飞;

  • 作者单位

    解放军军事医学科学院;

    中国人民解放军军事医学科学院;

  • 授予单位 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院;
  • 学科 微生物学
  • 授予学位 博士
  • 导师姓名 祝庆余;
  • 年度 2015
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 R373.13;
  • 关键词

    H5N1禽流感病毒; 血凝素蛋白; 受体结合域; 突变位点; 病毒致病性;

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