首页> 中文学位 >微量复杂生物样品糖蛋白N-糖链电喷雾电离质谱分析前处理方法的建立
【6h】

微量复杂生物样品糖蛋白N-糖链电喷雾电离质谱分析前处理方法的建立

代理获取

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1糖组与糖组学

1.2糖链的分类及特点

1.2.1糖链的分类

1.2.2糖链的特点

1.3糖链——一种潜在的生物标志物分子(Biomarker moleculer)

1.3.1糖链与恶性疾病的关系

1.3.2生物标志物分子

1.3.3糖链是一种潜在的生物标志物分子

1.4 N-糖链的解离方法

1.4.1糖蛋白的前处理

1.4.2 N-糖链的释放

1.5糖链的富集纯化方法

1.5.1凝集素亲和层析(Affinity chromatography)

1.5.2凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography,GFC)

1.5.3高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)

1.5.4固相萃取技术

1.5.5阳离子交换层析

1.5.6微晶纤维素柱法

1.5.7膜分离技术——滤纸片法

1.6糖链的质谱检测方法

1.6.1电喷雾电离质谱仪

1.6.2基质辅助激光解吸离子化质谱仪

1.6.3纳升电喷雾电离质谱仪

1.6.4傅里叶变换离子回旋共振质谱仪

1.7本研究的目的及意义

第二章糖蛋白N-糖链解离、富集纯化方法的考察

2.1引言

2.2实验部分

2.2.1实验试剂及仪器

2.2.2实验条件

2.2.3实验方法

2.3实验结果分析与讨论

2.3.1 N-糖链解离方法

2.3.2 N-糖链富集纯化方法

2.3.4 ESI-MS分析

2.4本章小结

第三章微量复杂生物样品糖蛋白N-糖链电喷雾电离质谱分析前处理方法的建立

3.1引言

3.2实验部分

3.2.1实验试剂与仪器

3.2.2实验条件

3.2.3实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1实验方法的改进

3.3.2微量复杂生物样品来源糖蛋白N-糖链的ESI-MS分析

3.4本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢

展开▼

摘要

糖生物学是21世纪生命科学研究的重要组成部分。要深入研究糖链在生命活动中的功能和调控机制,首要任务是获得并分析生物糖组。电喷雾电离质谱(ESI-MS)是目前分析微量糖组的强大工具,但对样品的前处理要求高。本文针对目前存在的问题建立了微量复杂生物样品糖蛋白N-糖链电喷雾电离质谱分析前处理的方法。本研究先以牛胰核糖核酸酶B和鸡卵清白蛋白二种常见的糖蛋白为研究材料,对几种N-糖链解离、富集纯化方法进行了考察,得到以下结论:
   ⑴N-糖链解离方法:选用十二烷基磺酸钠(SDS)和碘乙酰胺(DTT)作蛋白质的变性剂,100℃反应10min;加入磷酸钠缓冲液和10%乙基苯基聚乙二醇(NP40),然后加入N-糖苷酶F(PNGase F),37℃反应24 h。这种方法解离效果好,效率最高,操作简单。
   ⑵N-糖链富集纯化方法:我们将富集纯化方法联合使用,对解离样品进行质谱分析前处理,结果表明,除了微晶纤维素和阳离子交换树脂混合装柱法外,其余4种方法(微晶纤维素柱结合阳离子交换树脂,C18柱结合活性炭柱,C18柱结合阳离子交换树脂和活性炭柱结合微晶纤维素柱)均可以达到满意的富集纯化效果。我们将初步建立的方法用胎牛血清,健康小鼠血清,健康人血清,小鼠HAbl8 IgG以及HAbl8 IgG(腹水法)这5种生物样品进一步验证,并针对微量样品进行了改进:
   ⑶PVDF膜辅助N-糖链解离方法:我们利用PVDF膜能够结合蛋白质的特性,在释放糖链前对复杂生物样品进行粗纯化,再按照上述糖链解离步骤,直接在膜上完成糖蛋白变性和糖链解离过程。实验证明,这种方法能同时提高微量样品糖链纯化效果。
   ⑷改进的N-糖链富集纯化方法:上述4种富集纯化方法中,只有活性炭柱联合微晶纤维素柱纯化生物来源N-糖链解离样品的效果最好。在用活性炭柱进行纯化时,为了避免糖链洗脱不完全,我们用含0.1%三氟乙酸的50%的乙腈溶液为洗脱剂;微晶纤维素柱的平衡时间与填料多少成正比,平衡效果好坏直接影响纯化效果,而微量样品只需要少量的微晶纤维素,因此我们采用1000μL移液器标配枪头作一次性层析柱,可以大大减少干扰物,提高纯化效率。
   综上所述,本研究在电喷雾质谱检测技术的基础上,建立了一个更适合于微量生物来源样品糖蛋白N-糖链解离,富集纯化的新方法——采用PVDF膜辅助N-糖链解离方法以及活性炭柱联合微晶纤维素柱的富集纯化方法。这种方法快速,稳定,通用性更强,能够通量化应用于ESI-MS检测前μg级别生物样品糖蛋白N-糖链的制备,有利于糖组的后续研究。

著录项

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱:kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备:11010802029741号 ICP备案号:京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有
  • 客服微信

  • 服务号