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铜对畜禽粪便堆肥过程中微生物群落及抗性基因影响机理研究

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第一章 绪论

1.1 研究目的与意义

1.2 文献综述

1.3 主要研究内容与技术路线

第二章 铜对堆肥过程中细菌丰度和群落多样性的影响

2.1 材料与方法

2.2 结果与讨论

2.3 小结

第三章 铜对堆肥过程中氨氧化微生物群落及其基因丰度变化的影响

3.1 材料与方法

3.2 结果与讨论

3.3 小结

第四章 铜对堆肥过程中反硝化微生物群落及其基因丰度的影响

4.1 材料与方法

4.2 结果与讨论

4.3 小结

第五章 铜对堆肥过程中固氮微生物丰度及其群落变化的影响

5.1 材料与方法

5.2 结果与讨论

5.3 小结

第六章 铜对堆肥过程中抗铜基因和抗生素抗性基因的影响

6.1 材料与方法

6.2 结果与讨论

6.3 小结

第七章 结论与展望

7.1 主要结论

7.2 研究展望

参考文献

致谢

作者简介

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摘要

重金属作为饲料添加剂广泛应用于畜禽养殖业中，但大量的重金属会以原药形态残留于畜禽粪便中。好氧堆肥是处理畜禽粪便的重要方式，微生物参与堆肥过程多种有机物质的降解，是影响堆肥效率的重要因素；氮循环功能微生物是氮素转化的关键，直接影响堆肥产品质量。然而，堆肥产品的农业利用已成为抗性基因进入环境的重要途径，严重威胁人类健康。因此，本文以Cu作为畜禽粪便中典型重金属污染物，全面研究了不同浓度Cu对好氧堆肥过程中细菌群落多样性、氮循环功能基因及微生物群落多样性（硝化、反硝化和固氮过程）和抗性基因（抗Cu基因（Copper Resistance Genes，CRGs）、抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes，ARGs）及Ⅰ类整合子基因（intl1））的影响，分析了Cu与功能微生物和抗性基因变化的关系，揭示了不同浓度Cu对堆肥过程中功能微生物及抗性基因影响的微生物学机理。取得的主要结果和结论如下： （1）Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria 是堆肥过程中主要的细菌门，高浓度（2000 mg/kg）Cu处理使与纤维素和木质素降解相关的细菌丰度降低（如Bacilli和Truepera），尤其是在堆肥初期阶段。好氧堆肥中后期，高浓度（2000 mg/kg）Cu处理的细菌丰度显著降低，且与低浓度（200 mg/kg）Cu处理和对照处理细菌群落结构存在明显的差异。PICRUSt 分析表明，Cu 会降低编码纤维素、半纤维素和木质素降解酶预测基因丰度。Network分析表明，不同浓度的Cu会改变堆肥过程中细菌群落的关键微生物和共现性模式，加剧细菌间的竞争关系。冗余分析（RDA）结果表明，Cu、堆肥温度和水溶性有机碳（WSCs）是影响细菌群落变化的主要环境因子，且 Cu 主要影响高温和降温阶段细菌群落的变化。相关性分析结果表明Cu和部分潜在致病菌呈正相关关系（如Corynebacterium_1和Acinetobacter）。 （2）Cu会显著降低奶牛粪便好氧堆肥过程中的pH、NH4+-N、NO3 ?-N和潜在氨氧化势（PAO）。实时荧光定量 PCR（qPCR）测定结果表明，堆肥过程中氨氧化古菌（AOA）amoA基因丰度显著高于氨氧化细菌（AOB），低浓度（50 mg/kg）和高浓度（500 mg/kg）Cu处理会显著降低amoA基因丰度。变性凝胶电泳（DGGE）结果表明， Cu会改变堆肥过程AOA和AOB的群落结构和多样性。Nitrosomonas和Crenarchaeota是奶牛粪便堆肥中氨氧化过程的主导微生物。 （3）高浓度（2000 mg/kg）Cu处理在堆肥后期阶段显著增加nirS、nirK和nosZ反硝化基因丰度和多样性。Proteobacteria是反硝化细菌的主要门类，不同浓度Cu会影响堆肥反硝化细菌群落的组成。Network 分析结果表明，Steroidobacter、Nitrosomonas和Paracoccus是影响nirS、nirK和nosZ基因丰度变化的主要微生物，高浓度（2000 mg/kg） Cu处理可能会增加反硝化细菌之间的竞争关系，使反硝化细菌群落更加稳定。RDA结果表明，Steroidobacter、Nitrosomonas和Paracoccus与堆肥中Cu浓度正相关，主要分布在2000 mg/kg Cu处理样品中。 （4）在猪粪好氧堆肥前期，nifH 基因丰度显著高于其他阶段，但 Cu 会显著降低堆肥中nifH基因丰度。Cu会改变堆肥前期固氮微生物群落结构，减少固氮微生物群落的多样性。Firmicutes和Clostridium是堆肥过程中丰度最高的固氮微生物门和属，低浓度（200mg/kg）和高浓度（2000 mg/kg）Cu会减少堆肥过程中Desulfotomaculum、Desulfovibrio和Paenibacillus相对丰度，增加Cupriavidus丰度。Network分析结果表明， Cu 会影响堆肥过程固氮微生物群落的共现模式，减少固氮微生物之间的联系。此外， Cu可能会削弱堆肥过程中共生固氮细菌的作用，增加自生固氮菌的作用。 （5）经过好氧堆肥后，堆肥产品中pcoA、tcrB、erm（A）、erm（B）和intl1基因的绝对丰度显著下降，而copA和cusA显著上升。高浓度（2000 mg/kg）Cu处理会减缓好氧堆肥对CRGs、ARGs和intl1基因绝对丰度的削减作用。RDA结果表明，NH4+和NO3?对ARGs、CRGs和intl1的分布起重要作用，堆肥温度是造成ARGs、CRGs和intl1丰度降低的主要因素。pcoA、tcrB、erm（A）、erm（B）和intl1与生物有效态Cu浓度呈显著正相关关系。在细菌属水平，Clostridium_sensu_stricto_1主导堆肥升温和高温阶段，Pseudomonas和Corynebacterium_1主导降温和腐熟阶段。Network分析结果表明，细菌群落是影响CRGs、ARGs和intl1变化的主要因素。堆肥温度、Cu和细菌群落组成的变化是影响含Cu猪粪好氧堆肥过程中CRGs、ARGs和intl1变化的重要因素。

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