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溶菌酶修饰的庆大霉素脂质体对抗细菌生物膜的研究

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论文说明

摘要

第一章 文献综述

1.1 细菌生物膜

1.1.1 细菌生物膜的含义及特点

1.1.2 细菌生物膜的形成机制

1.1.3 细菌生物膜的抗性机制

1.1.4 细菌生物膜的危害

1.1.5 细菌生物膜的防治手段

1.2 脂质体与细菌生物膜

1.2.1 脂质体的结构与种类

1.2.2 脂质体的特点

1.2.3 脂质体的应用

1.2.4 脂质体的制备方法

1.3 氨基糖苷类抗生素

1.4 溶菌酶

1.4.1 溶菌酶溶解细菌原理

1.4.2 溶菌酶的特性

1.4.3 溶菌酶的应用

1.5 本文立题依据及意义

1.5.1 立题依据

1.5.2 选题意义

第二章 溶菌酶修饰的庆大霉素脂质体的制备及表征

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 主要试剂

2.2.2 主要仪器

2.3 实验方法

2.3.1 负载庆大霉素脂质体的制备

2.3.2 庆大霉素包封率的测定

2.3.3 构建溶菌酶修饰的庆大霉素脂质体

2.3.5 稳定性实验

2.3.6 体外释放动力学测定

2.4 结果与分析

2.4.1 庆大霉素包封率的分析

2.4.2 DLS结果分析

2.4.3 稳定性评价

2.4.4 体外释放结论

2.5 小结与讨论

第三章 溶菌酶修饰的庆大霉素脂质体的抗生物膜活性评价

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 主要材料

3.2.2 主要试剂

3.2.3 主要仪器

3.3 实验方法

3.3.1 细菌生物膜的构建

3.3.2 对已形成生物膜的作用

3.3.3 荧光显微镜观察生物膜

3.3.4 场发射扫描电子显微镜观察生物膜

3.3.5 对正在形成生物膜的作用

3.3.6 结合能力实验

3.4 结果与分析

3.4.1 对已形成生物膜的破坏效果

3.4.2 荧光显微镜表征

3.4.3 扫描电镜分析

3.4.4 对正在形成生物膜的抑制效果

3.4.5 结合能力表征

3.5 小结与讨论

第四章 结论与创新点

4.1 研究结论

4.2 创新点

参考文献

致谢

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摘要

细菌生物膜引发的慢性感染是临床上棘手的问题之一。由于细菌生物膜对抗生素具有高度耐药性,而在缺乏新抗生素或者高效抗菌策略的前提下,只能加大现有抗生素的使用剂量、延长给药时间。长此以往,容易导致耐药性和耐药菌株的产生,同时,抗生素的毒副作用也会增加。因此,通过改良抗生素的现有给药方式,降低抗生素的使用剂量,提高作用效果,可以为细菌生物膜感染的治疗提供更好的解决办法。本文采用生物相容性好的带正电荷的溶菌酶修饰带负电荷的脂质体,提高了脂质体的稳定性,增强了对细菌生物膜的亲和力,提升了庆大霉素对生物膜的作用效果。具体研究内容如下:
  采用1,2-棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)和二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC),通过挤压法制备了庆大霉素脂质体(LG),经磷钨酸钠沉淀法测定可知庆大霉素的包封率为0.6%。其次利用静电作用将带正电荷的溶菌酶吸附到负电荷的脂质体表面得到溶菌酶修饰的庆大霉素脂质体(LLG)。根据表面Zeta电位由LG的负值向LLG的正值转变可知,溶菌酶成功吸附到了脂质体表面。通过定时检测48h内LG及LLG的粒径变化可知,溶菌酶的引入可以稳定脂质体。利用紫外分光光度计实时监测72h内LG及LLG体外释放庆大霉素含量发现,LG在前48h内,庆大霉素释放量超过了50%,而在72h时70%以上的药物已经释放。相反地,在72h时也仅有14%的药物从LLG中释放出来。由此也证明了溶菌酶吸附到庆大霉素脂质体表面可以有效改善脂质体的稳定性。通过体外构建铜绿假单胞杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)生物膜,利用结晶紫染色法和MTT实验评价发现,与单独庆大霉素相比,LLG在破坏已形成的细菌生物膜和抑制细菌生物膜形成时更为有效。通过荧光显微镜及扫描电镜观察细菌生物膜发现,LLG不仅破坏了生物膜的形态及内部结构,也影响了单个细菌的形态结构。通过荧光定量罗丹明B与细菌生物膜的结合量,探讨了LLG破坏细菌生物膜的潜在机制,结果显示,LLG能更有效的吸附于负电荷的生物膜,进而定点释放药物,从而达到增强LLG的抗生物膜效果。
  综上所述,溶菌酶稳定脂质体的策略是可行的,LLG能够在一定程度上降低抗生素的使用剂量,减缓耐药菌株的形成,同时,也有助于减小抗生素的毒副作用。该策略为使用抗生素治疗细菌生物膜相关的顽固性感染提供了一种新的方案。

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