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雏鸡心肌细胞原代培养及锰对肉仔鸡心肌细胞MnSOD基因表达调控研究

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文献综述:第一章动物细胞培养研究概况

1.1培养细胞的生物学特性

1.1.1细胞在体内、体外的差异和分化

1.1.2体外培养细胞的分型

1.1.3培养细胞的生长和增殖过程

1.2细胞培养发展简史

1.3影响动物细胞培养的因素

1.3.1动物种属

1.3.2细胞类型及细胞代数

1.3.3培养条件

1.4培养细胞的应用

1.4.1动物育种

1.4.2生物学基础研究

1.4.3生产大分子生物制品

文献综述:第二章MnSOD基因表达调控研究进展

2.1 MnSOD的结构

2.2 MnSOD的分子生物学及遗传学特征

2.3转录水平调控

2.3.1某些药物对MnSOD基因表达的调控

2.3.2金属离子对MnSOD基因表达的影响

2.3.2个别基因对MnSOD基因表达的调节

2.4转录后水平调控

2.5翻译后水平调控

2.6 MnSOD的应用

2.7结语与展望

文献综述:第三章雏鸡心肌细胞原代培养研究

3.1试验材料与方法

3.1.1试验动物

3.1.2耗材及主要仪器

3.1.3主要试剂

3.1.4主要溶液及配制方法

3.1.5培养方法

3.1.6培养细胞的免疫细胞化学染色(亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法,ABC法)

3.1.7统计学方法

3.2结果与分析

3.2.1原代细胞培养

3.2.2不同培养液对鸡心肌组织培养的影响

3.2.3不同消化法对鸡心肌细胞获得的影响

3.2.4不同消化时间对鸡心肌细胞获得的影响

3.2.5免疫细胞化学染色

3.3讨论

3.3.1关于细胞分离培养

3.3.2不同日龄鸡心肌细胞的生长情况比较

3.3.3三种培养液的比较

3.3.4不同消化法的比较

3.3.5不同消化时间的比较

3.3.6关于免疫细胞化学鉴定

3.4 小结

文献综述:第四章锰对肉仔鸡心肌细胞MnSOD活性影响的研究

4.1材料和方法

4.1.1主要仪器及试剂

4.1.2主要溶液的配制方法

4.1.3动物与饲粮

4.1.4细胞培养

4.1.5样品采集及处理

4.1.6样品分析

4.1.7统计学方法

4.2结果与分析

4.2.1不同锰水平及培养时间对细胞蛋白量的影响

4.2.2不同锰水平及培养时间对心肌细胞MnSOD活性的影响

4.3讨论

4.3.1关于锰对细胞蛋白浓度的影响

4.3.2关于锰对细胞MnSOD活性的影响

4.4 小结

文献综述:第五章锰对肉仔鸡心肌细胞MnSOD mRNA表达影响研究

5.1材料

5.1.1主要仪器

5.1.2主要试剂

5.1.3主要溶液配制

5.2方法

5.2.1动物与饲粮:

5.2.2细胞培养:

5.2.3样品采集

5.2.4样品分析

5.1.3统计学方法

5.2结果

5.2.1鸡MnSOD片段PCR产物测序结果

5.2.2鸡心肌细胞MnSOD mRNA定量结果

5.3讨论

5.3.1关于Real Time PCR

5.3.2关于MnSOD mRNA的表达

5.4 小结

结论

参考文献

致谢

作者简介

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摘要

MnSOD是动物体内重要的抗氧化剂,能催化分解生物体氧化过程中产生的有毒物O2-·为O2和H2O2,从而防治多种与之有关的疾病,具有抗氧化应激和抗癌的功能。肉仔鸡的生长发育快,体内代谢比较旺盛,代谢过程中产生的有毒O2-·较多,尤其是在心脏等代谢旺盛的器官。MnSOD是肉仔鸡体内一种重要O2-·清除剂,在肉仔鸡抗氧化应激体系中起关键作用,而锰作为MnSOD的组成部分,对MnSOD基因的表达调控发挥着重要作用。本研究采用体外法研究锰对肉仔鸡心肌细胞MnSOD基因的表达调控作用。研究分为三个部分:(1)雏鸡心肌细胞原代培养;(2)锰对肉仔鸡心肌细胞MnSOD活性的影响;(3)锰对肉仔鸡心肌细胞MnSOD mRNA表达的影响。 1.采用组织贴块法和酶消化法结合差速贴壁法培养肉仔鸡心肌细胞,并对培养的细胞进行免疫细胞化学染色以鉴定是否为心肌细胞。分别应用胰蛋白酶和胶原酶对心肌组织块进行消化,通过观察细胞成活率以判定哪种消化酶更适合心肌组织的消化,应用0.12%的胶原酶对心肌组织分别消化5min、10min、15min,确定较好的消化时间。利用MDM、DMEM/F12、DMEM三种培养基培养心肌细胞,筛选合适的培养基。结果表明:贴块法简便、易操作,但是心肌细胞收获周期长,纯度相对较低,酶消化法操作相对较复杂,但是细胞收获周期短,纯度较高,采用差速贴壁和添加Brdu的方法来抑制成纤维细胞的增殖,能较好的控制心肌细胞纯度;免疫细胞化学染色结果表明,培养的细胞为心肌细胞。胶原酶比胰蛋白酶更适合鸡心肌组织块的细胞分离消化;0.12%的Ⅰ型胶原酶37℃分次消化,每次消化10min能够较好的分离心肌细胞;MDM和DMEM/F12培养基比DMEM培养基更适合鸡心肌细胞的培养。 2.将经缺锰饲粮饲喂7d的肉仔鸡处死后用于鸡心肌细胞培养,将培养5~7d长成单层的心肌细胞分别加入含0.1、0.5、1.0、2mM/L无机硫酸锰的培养基溶液,同时设不加锰的对照组,每个处理3个重复,每个重复2细胞培养孔,在加入培养液后的6、12、24、48h时分别采集细胞。按照超氧化物歧化酶(SOD)分型测试盒提供的方法测定肉仔鸡心肌细胞MnSOD的活性。结果表明:添加0.1、0.5、1.0mM/L浓度锰的心肌细胞MnSOD活性与不加锰的心肌细胞MnSOD活性无显著差异,而添加2.0mM/L浓度锰的心肌细胞MnSOD活性要显著高于其他各组的MnSOD活性;添加锰后的6~24h里心肌细胞MnSOD活性变化不大,当培养至48h时心肌细胞MnSOD活性有明显升高。由此可知,用2.0mM/L无机硫酸锰处理心肌细胞48h,其MnSOD活性升高最大。 3.将经缺锰饲粮饲喂7d的肉仔鸡处死后用于鸡心肌细胞培养,将培养5~7d长成单层的心肌细胞分别加入含0.1、0.5、1.0、2mM几无机硫酸锰的培养基溶液,同时设不加锰的对照组,每个处理3个重复,每个重复2细胞培养孔,在加入培养液后的6、12、24、48h时分别提取细胞的总RNA。经纯化后,用荧光定量PCR法对MnSOD mRNA进行定量。结果表明:用加锰培养基分别培养心肌细胞6、12、48h,各组心肌细胞MnSOD mRNA水平无显著差异,而24h的MnSOD mRNA水平显著高于其它各组,表达量最高。添加0.1mM、0.5mM、1.0mM、2mM/L浓度锰的心肌细胞MnSOD mRNA水平均高于不加锰组的MnSOD mRNA水平,但差异不显著。

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