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乙型肝炎病毒基本核心启动子/前核心区和逆转录酶区变异的临床特点与意义研究

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第一章 HBV BCP/PC区基因变异及基因型特点与肝病进展的相关性分析

第一节 AHB和CHB患者HBV BCP/PC区基因变异和基因型特点及临床意义分析

第二节 大样本轻中度、重度慢乙肝及慢加急性肝衰竭患者HBV BCP/PC区变异特点及临床意义分析

第二章 HBV逆转录酶区耐药基因变异特点及临床意义分析

第一节 1803例经核苷（酸）类药物治疗的慢性HBV 感染患者RT区耐药相关变异特点及临床意义分析

第二节 1例新型多重耐药HBV变异株的演变特点及其感染的临床治疗分析

全文总结及创新点

参考文献

文献综述

参考文献

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摘要

研究背景:乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)感染可引起多种临床表现,包括无症状HBV携带状态、急性乙型肝炎、轻中度或重度慢性乙型肝炎,并可进一步发展为肝硬化、肝细胞癌和慢加急性肝衰竭。我国有9300万慢性HBV感染者,其中慢性乙型肝炎患者约2000万人,乙肝肝硬化患者约400万人,每年约28万人死于肝细胞癌。而慢加急性肝衰竭患者每年可造成2万多人死亡,其发生与机体对感染病毒产生过强的免疫应答相关,而病毒基因变异可能是引起机体免疫应答异常的一个重要因素。
　　HBV具有高变异特性,虽是DNA病毒,其复制却与逆转录病毒类似存在一个RNA中间体的逆转录过程,而参与此过程的HBVDNA多聚酶/逆转录酶(reverse transcriptase,RT)缺乏严格的校对功能,使病毒复制过程中的碱基错配率明显高于其他DNA病毒。HBV也是高复制率病毒,每天病毒基因组中每个碱基都有发生所有碱基替换的可能。此外,HBV的复制模板共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)半衰期长,稳定存在于感染的肝细胞核中,是HBV持续感染的根本原因。在自然感染状态下HBV是以野生株为优势株的准种群形式存在,根据HBV基因组序列差异分为8种不同的基因型(≥8％)和若干基因亚型(≥4%)。各种基因型HBV的病毒学特点不同,也可影响肝病的临床转归。
　　HBV基因组最常见的热点变异是基本核心启动子(basal core promoter,BCP)区和前核心(precore,PC)区变异。HBVPC区编码的e抗原(hepatitis B eantigen,HBeAg)是一种免疫耐受抗原,而BCP区转录调节HBeAg表达,发生在这两个区的变异可终止或减低HBeAg表达,增强病毒复制力或逃避宿主免疫应答。另一方面,由于HBeAg与HBV核心抗原(HBcAg)共有相同的免疫表位,该区变异也增加了免疫系统对HBcAg的攻击,可能与乙肝进展及重症化相关。研究表明HBVBCP/PC区变异可能与急性重型肝炎的发生相关,但也有不同的研究结果。基因型又可以影响BCP/PC区变异的发生率,增加结果分析的复杂性。关于HBVBCP/PC变异和基因型与慢加急性肝衰竭发生的相关性分析少见报道。本研究的第一部分系统分析了我国临床大样本急性乙肝、轻中度慢乙肝、重度慢乙肝和慢加急性肝衰竭患者的BCP/PC区变异和基因型特点以及临床意义,结果有助于理解HBV病毒学特点在乙型肝炎慢性化、重症化机制中的作用。
　　当前,核苷(酸)类似物是临床最常用的抗HBV感染治疗药物,包括三种核苷类,即拉米夫定(lamivudine,LAM)、恩替卡韦(entecavir,ETV)和替比夫定(tebivudine,LdT),两种核苷酸类,即阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,ADV)和富马酸替诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate,TDF),前四种已在我国临床批准使用。这些药物通过直接靶向HBVRT区而发挥抗病毒作用,但均不能从根本上清除感染肝细胞核中持续存在的HBVcccDNA,一旦停药反跳率高,因此需要长期抗病毒治疗。
　　然而长期抗病毒治疗会使病毒在药物压力下获得适应性变异或使预存于准种群中的极少量变异株获得选择性扩增,产生耐药病毒导致治疗失败,成为临床面临的棘手问题。发生在HBV逆转录酶区的耐药变异分为直接降低药物敏感性的原发耐药变异和增强病毒复制力的补偿变异,还有一些与ADV耐药相关的有争议的变异。随着临床上可选择的药物增多,耐药及交叉耐药的风险增加,变异形式也更加多样化。此外,不适当的核苷(酸)类药物序贯使用促进了多重耐药病毒株的产生。
　　已有的关于耐药变异病毒的研究大多来源于一些临床试验研究,用药方式相对固定,研究的样本量有限,但实际上临床用药方式复杂,引起的HBV耐药变异谱有其特有规律,以往尚缺少大样本分析数据。本研究的第二部分系统分析了我国大样本经核苷(酸)类药物治疗的慢性HBV感染者HBV基因耐药谱,并对1例我们新鉴定的针对LAM、ADV和ETV的新型多重耐药HBV变异株的临床演变特点和感染的临床治疗进行动态分析。结果为全面了解我国临床实际治疗中的HBV耐药谱提供新的信息,对于帮助我国HBV耐药管理的规范化具有重要意义。
　　目的:
　　(1)分析临床较大样本急性乙肝、轻中度慢乙肝、重度慢乙肝和慢加急性肝衰竭患者HBV基因型和BCP/PC区变异特点,揭示HBV基因型和BCP/PC区变异在不同病程HBV感染患者的表现特点和与疾病进展的相关性。
　　(2)分析临床较大样本慢性HBV感染者RT区多位点核苷(酸)类似物耐药相关变异及其临床意义,揭示我国临床HBV耐药发生频率、四种核苷(酸)类似物基因型耐药变异特点及多重耐药HBV变异株的演变特点和感染的临床治疗策略。
　　方法:
　　(1)收集182例急性乙肝、325例轻中度慢乙肝、170例重度慢乙肝和298例慢加急性肝衰竭患者血清。提取HBVDNA,应用单管巢式聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),扩增HBVRT(含S)基因和BCP/PC区基因,对PCR产物进行双向测序。根据RT/S区序列用MEGA4软件进行分子进化树分析确定HBV基因型,用VectorNTI软件比对分析文献报道的具有(潜在)临床意义的10个位点的核苷酸变异,包括BCP区1753、1754、1758、1762、1764、1766和1768位点变异和PC区的1862、1896和1899位点变异。
　　(2)收集1803例经核苷(酸)类似物长期治疗的慢性HBV感染患者血清,扩增HBVRT区全长基因,对PCR产物进行双向测序,分析rt80、rt84、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt214、rt215、rt217、rt233、rt236和rt250共15个位点的耐药相关变异特点。并进一步对1例新型多重耐药HBV感染患者系列血清样本的耐药变异及HBVDNA载量、转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)等指标进行检测,结合克隆测序(>20个克隆/样本/时间点)结果,分析多重耐药HBV株的动态演变规律、表型耐药特点和感染的临床治疗策略。
　　结果:
　　(1)急性乙肝患者HBVB基因型与C基因型比例和BCP/PC区野生株比例显著高于慢性乙肝患者。急性乙肝患者HBVBCP区A1762T、G1764A和前C区G1896A、G1899A的检出率显著低于慢性乙肝患者,但BCP区T1758C的检出率却显著高于慢性乙肝患者,且T1758C变异与A1762T/G1764A变异有相互排斥倾向。与C基因型HBV相比,B基因型HBVBCP区变异频率更低,PC区变异频率相似。在含四种基本BCP/PC变异模式的急性乙肝患者间ALT水平相似,而含PC区变异的慢性乙肝患者ALT水平更高;含有BCP/PC区双变异的急性乙肝患者HBVDNA载量更高,而相应的慢性乙肝患者HBVDNA载量更低;急性乙肝患者的HBeAg阴性率高于慢性乙肝患者,且BCP/PC区双变异的急性乙肝患者HBeAg阴性率更高,而慢性乙肝患者随着BCP/PC区变异的累积HBeAg阴性率呈逐级增高趋势。
　　(2)与慢性乙肝患者相比,慢加急性肝衰竭患者HBVBCP区T1753C/A/G、A1762T、G1764A、C1766T变异频率和前C区G1862T、G1896A、G1899A变异频率显著增高。而且,A1762T/G1764A双联变异和G1896A热点变异频率以及10个分析位点的平均碱基替代数目随着疾病进展(轻中度慢乙肝<重度慢乙肝<慢加急性肝衰竭)逐级增高。与C基因型HBV相比,B基因型HBV的BCP区变异频率明显降低,而PC区变异频率明显增高。与HBVBCP区变异不同的是,在上述三种疾病类型中HBVPC区变异均显著影响HBeAg向抗HBe的血清学转换。此外,感染了PC变异株的慢加急性肝衰竭患者比感染了PC野生株的患者病死率明显增高。
　　(3)1803例患者中有560例检出耐药相关变异,其中214例来自490例接受LAM单一治疗的患者,35例来自428例接受ADV单一治疗的患者,5例来自18例接受LdT单一治疗的患者以及306例来自794例接受序贯或联合抗病毒治疗的患者,而在73例接受ETV单一治疗的患者中未检出耐药变异。381例接受LAM耐药后换成ADV继续治疗患者中有36例(9.4%)检出ADV耐药变异,而LAM耐药后加用ADV继续治疗的82例患者中仅1例(1.2%)检出ADV耐药变异。ETV耐药变异不仅在LAM和ETV经治的患者中检出,而且在LAM单一治疗的患者中也检出。tL180M+rtM204I双变异株检出频率在C基因型HBV较B基因型HBV更常见,并且感染了此种双变异株的患者ALT水平明显高于感染了rtM204I单一变异HBV株的患者。值得注意的是,在8例患者中检出多重耐药HBV变异株。
　　(4)我们对1例新型多重耐药HBV变异株感染的慢乙肝患者进行随访,该患者自2002年6月起先后序贯接受了长达116个月的抗病毒治疗,即10个月的LAM与干扰素-α2b联合治疗、23个月的LAM单一治疗、13个月的ADV单一治疗、12个月的ETV单一治疗、12个月的ADV与干扰素-α2b联合治疗、6个月的ADV单一治疗、40个月的ADV加用LAM联合治疗。目前HBVDNA维持检测不到水平,ALT水平正常。克隆测序显示病毒准种池中多重耐药HBV株的动态演变过程,即由最初的野生株,LAM耐药株rtM204I,ADV耐药株rtA181V和rtA181T,LAM耐药株rtL180M+rtM204V,ETV耐药株rtL180M+rtS202G+rtM204V,ADV耐药株rtN236T±rtA181T,多重耐药株rtL180M+rtA181V+rtS202G+rtM204V+rtN236T和rtL180M+rtS202G+rtM204V+rtN236T,到ETV耐药株rtL180M+rtS202G+rtM204V。
　　结论:
　　(1)感染了B基因型HBV、BCP/PC区野生型HBV、BCP区T1758C变异型HBV更易发展为急性乙肝,而慢性乙肝的发生与BCP/PC区变异的累积密切相关。
　　(2)HBVBCP/PC区变异与慢性乙肝的疾病进展呈正相关,BCP/PC区变异HBV感染的慢乙肝患者更易发生重症肝炎以及慢加急性肝衰竭,具有PC变异株的慢加急性肝衰竭患者具有更高死亡风险。
　　(3)虽然仅四种核苷(酸)类药物在我国临床使用,临床上实际抗病毒治疗组合方案多达40余种,HBV耐药变异形式也复杂多样,长期不规范用药促进了耐药及多重耐药HBV变异株的产生,为治疗带来更大的挑战。HBV基因型耐药谱的数据分析对于我国乙肝耐药管理具有重要临床意义。
　　(4)多重耐药病毒是在病毒准种池中复杂的单药和双药耐药病毒基础上产生的。该病例中鉴定的三种新型多重耐药HBV株为国际上首次报道,并且在我国目前TDF未上市的情况下应用LAM与ADV联合治疗可抑制多重耐药HBV株的复制。结果为我国治疗多重耐药HBV感染提供了借鉴。

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