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1.妊娠后期暴露过量糖皮质激素所致子代抑郁样行为的机制研究；2.雌激素缺乏所致抑郁样和焦虑样行为的机制研究

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第一部分 妊娠后期暴露过量糖皮质激素所致子代抑郁样行为的机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

第二部分 雌激素缺乏所致抑郁样和焦虑样行为的机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

文献综述 中枢神经系统NLRP3炎性小体研究进展

博士在读期间发表论文

致谢

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摘要

抑郁症是一种常见的慢性精神系统疾病，其发病机制非常复杂。随着成人疾病胎儿起源学说的提出，越来越多的研究证实，很多精神系统疾病的病因可以追溯至胎儿期。胎儿期母体所受各种不良环境应激，可以导致胎儿体内糖皮质激素(GCs)水平升高。而过早、过量的GCs暴露能够编程并改变脑内某些关键基因的表达，增加其成年后罹患抑郁症、焦虑等精神系统疾病风险。临床上对于具有早产风险的孕妇都会给予人工合成的糖皮质激素，以促进胎儿肺成熟、降低呼吸窘迫综合征发生率和早产儿死亡率。
　　因此，本课题的第一部分，我们首先构建了妊娠后期暴露过量GCs大鼠模型，待其子代成年后运用糖水消耗实验、强迫游泳实验、悬尾实验和旷场实验检测其行为改变情况。行为学测试结束后将部分成年F1代两两交叉繁殖成F2代，待其成年后再次检测行为改变情况。与此同时，运用高通量全基因组表达谱芯片筛选出模型大鼠脑内抑郁关键分子，并运用分子生物学实验技术探究妊娠后期暴露过量GCs对子代脑区关键分子表达调控及抑郁样行为跨代传递的机制。
　　在本课题的第二部分，我们通过去卵巢手术构建雌激素缺乏动物模型，借此观察雌激素缺乏对动物抑郁样行为的影响。然后通过雌激素、不同类型雌激素受体激动剂和炎性小体抑制剂替代治疗，观察其对去卵巢小鼠抑郁样和焦虑样行为的影响。在此基础上，运用分子生物学方法研究雌激素抗抑郁、抗焦虑效应的分子机制。主要实验结果如下:
　　第一部分 妊娠后期暴露过量糖皮质激素所致子代抑郁样行为的机制研究
　　一、妊娠后期暴露过量糖皮质激素所致子代抑郁样行为及其跨代传递
　　（一）妊娠后期暴露过量糖皮质激素导致成年F1代抑郁样行为增加
　　F1代大鼠行为学实验结果显示:与Con组相比，DEX组大鼠糖水消耗百分比降低，强迫游泳和悬尾实验中不动时间增加，旷场实验中中央活动路程和穿梭次数减少，且无性别差异。表明，妊娠后期暴露过量GCs导致成年F1代大鼠抑郁样行为增加。
　　（二）妊娠后期暴露过量糖皮质激素所致子代抑郁样行为的跨代传递
　　F2代大鼠行为学实验结果显示:与Con♂/Con♀组相比，Con♂/DEX♀、DEX♂/DEX♀组大鼠表现出明显的抑郁样行为，如糖水消耗百分比降低，悬尾实验中不动时间增加，旷场实验中中央活动路程和穿梭次数减少。DEX♂/Con♀组大鼠糖水消耗百分比降低，但在悬尾实验和旷场实验中其行为均未发生明显改变。以上行为学实验结果表明，妊娠后期暴露过量糖皮质激素F1代大鼠抑郁样行为主要通过母亲传递到F2代。
　　二、妊娠后期暴露过量糖皮质激素所致子代抑郁样行为及其跨代传递的机制
　　（一）妊娠后期暴露过量糖皮质激素F1代大鼠海马CRH、CRHR1表达增加
　　1.全基因组表达谱芯片筛选海马脑区差异表达基因
　　全基因组表达谱分析结果显示:雄性F1代Con组、DEX组大鼠海马与脑功能相关基因CRH、5-HT1A、Olr840、Olr232、Aldh1a2和Ubd的表达均发生明显改变。Real-time PCR结果表明:DEX组大鼠海马CRH mRNA表达较Con组明显增加，且无性别差异。而Aldhla2、Olr840、Olr232和Ubd mRNA表达存在明显的性别差异，这一结果与F1代DEX组大鼠抑郁样行为无明显性别差异相矛盾。提示，Aldhla2、Olr840、Olr232和Ubd不是妊娠后期暴露过量GCs所致子代抑郁样行为的关键基因。
　　2.妊娠后期暴露过量糖皮质激素子代海马CRH、CRHR1表达增加
　　Real-time PCR和Western blot结果显示:成年和E18天F1代DEX组大鼠海马CRH、CRHR1 mRNA和蛋白表达较Con组明显升高且无性别差异，而CRHR2 mRNA和蛋白表达均无明显改变。提示，海马CRH、CRHR1参与妊娠后期暴露过量GCs所致子代抑郁样行为增加。
　　（二）海马CRHR1高表达导致大鼠抑郁样行为增加
　　1.CRHR1特异性拮抗剂CP154526能够改善妊娠后期暴露过量糖皮质激素所致子代大鼠的抑郁样行为
　　F1代DEX组大鼠出生后第2天起，每天一次皮下注射CRHR1特异性拮抗剂CP154526，对照组注射等量的生理盐水，连续给药7天，待其成年后观察抑郁样行为。结果发现:与Con组相比，注射CP154526后DEX组大鼠抑郁样行为明显改善且无性别差异。如糖水消耗百分比增加，强迫游泳和悬尾实验中不动时间减少，旷场实验中中央活动路程增加。
　　2.海马CRHR1过表达大鼠抑郁样行为增加
　　正常雄性SD大鼠海马注射CRHR1过表达慢病毒载体，4周后分别运用Westernblot方法检测海马CRHR1表达和行为学实验方法检测其抑郁样行为。结果显示:海马注射过表达CRHR1慢病毒4周后，CRHR1表达明显增加。同时，糖水消耗百分比降低，悬尾实验中不动时间增加，旷场实验中中央活动路程和穿梭次数减少。提示，海马CRHR1过表达能够导致动物表现出明显的抑郁样行为。
　　（三）F1代海马CRHR1高表达能够通过母亲传递到F2代
　　Real-time PCR和Western blot方法分别检测F2代E18和成年时海马CRH、CRHR1表达。结果显示:F2代Con♂/DEX♀、DEX♂/DEX♀组大鼠海马CRH和CRHR1表达增加，而CRHR2表达并未发生明显改变。以上实验结果提示，F1代海马CRH和CRHR1高表达可以通过母亲传递到F2代。
　　第二部分 雌激素缺乏所致抑郁样和焦虑样行为的机制研究
　　（一）ERβ激动剂DPN能够改善OVX小鼠抑郁样和焦虑样行为
　　1.ERβ激动剂DPN能够改善OVX小鼠抑郁样行为
　　行为学实验结果显示:与Sham组相比，OVX组小鼠糖水消耗百分比显著降低，悬尾不动时间增加。E2(10μg/kg、30μg/kg)、DPN(30μg/kg)可以增加OVX小鼠糖水消耗百分比。OVX小鼠连续给予30μg/kg E2和DPN4周能够显著降低悬尾不动时间，而10μg/kg E2和DPN对悬尾实验不动时间无显著影响。PPT(10μg/kg、30μg/kg)对OVX小鼠的抑郁样行为均无显著影响。
　　2.ERβ激动剂DPN能够改善OVX小鼠焦虑样行为
　　行为学实验结果显示:在EZM实验中，OVX组小鼠在开放臂活动时间和进入开放臂活动次数较Sham组明显减少。OVX组小鼠连续给予E2和DPN(30μg/kg)4周能够显著增加其在开放臂活动时间、进入开放臂的次数。连续给予10μg/kg E2和DPN4周能分别增加动物在开放臂的活动时间和进入开放臂活动的次数。在OFT实验中，OVX组小鼠中央活动路程、中央活动时间和穿越次数较Sham组显著减少。OVX组小鼠连续给予E2和DPN(30μg/kg)4周能够显著增加中央活动路程、穿越次数和中央活动时间。而连续给予10μg/kg E2和DPN4周对旷场实验相关指标均无显著影响， PPT(10μg/kg/day、30μg/kg/day)连续给药4周对上述行为学指标均无明显的改善作用。
　　（二）ERβ激动剂DPN能够改善OVX小鼠海马炎症反应
　　ELISA结果显示:OVX组小鼠海马IL-1β、IL-18含量较Sham组显著增加，连续给予30μg/kg E2、DPN4周，能显著降低OVX组小鼠海马IL-1β、IL-18水平，而PPT对海马IL-1β、IL-18水平无显著影响。Real-time PCR结果显示:OVX组小鼠IL-1β、IL-18mRNA表达较Sham组显著增加。连续给予30μg/kg E2、DPN4周能够逆转OVX引起的海马IL-1β、IL-18 mRNA的高表达。Western blot结果显示:OVX小鼠海马成熟的IL-1β、IL-18含量较Sham组显著增加，同时，IL-1β、IL-18前体Pro-IL-1β、Pro-IL-18蛋白表达也较Sham组显著增加。连续给予30μg/kg E2、DPN4周能够逆转OVX引起的海马Pro-IL-1β、Pro-IL-18、IL-1β和IL-18的高表达。
　　此外，我们还探究了前额皮质和杏仁体IL-1β、IL-18的表达情况。结果发现OVX组小鼠前额皮质和杏仁体IL-1β、IL-18表达较Sham组无明显改变。而PPT、DPN给药4周对上述脑区IL-1β、IL-18的表达无显著影响。
　　结论:
　　1.妊娠后期暴露于过量GCs能够导致F1代抑郁样行为增加，并且这种抑郁样行为可以通过母系传递到F2代。其机制可能与GCs导致F1代海马低甲基化进而引起海马CRHR1高表达有关。
　　2.雌性F1代海马GR表达减少使HPA轴负反馈失衡导致HPA轴持续性激活，进而导致其在妊娠过程中胎盘11β-HSD1表达增加、胎儿血清皮质酮水平增加。高浓度血清皮质酮通过表观遗传学机制上调海马CRHR1的表达，后者导致F2代抑郁样行为母源性增加。
　　3.雌激素和ERβ激动剂DPN能够改善OVX小鼠抑郁样和焦虑样行为。其机制可能是通过抑制OVX小鼠海马NLRP3炎性小体，进而抑制海马小胶质细胞激活、降低促炎细胞因子IL-1β、IL-18表达。
　　4.OVX能够激活TLR-2、TLR-4及其下游的MyD88、NF-kB信号通路和P2X7R。NLRP3炎性小体抑制剂VX-765能够抑制海马促炎细胞因子IL-1β、IL-18表达，进而改善OVX小鼠抑郁样和焦虑样行为。

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