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Orai1/CRACM1在内毒素引起钙超载中的机制研究

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细菌内毒素(Endotoxin)是革兰氏阴性细菌(GNB)细胞壁外膜层的主要组分,其主要化学成分是脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)。内毒素是强致炎因子，在血管内皮细胞受损和/或功能异常过程中起了重要作用。内毒素诱导内皮细胞程序性死亡或凋亡被认为是脓毒症及其并发症形成过程中的重要事件[1,2]。
　　 钙离子作为重要的第二信使，参与许多决定细胞生死的病理生理过程。细胞内钙离子代谢异常、钙稳态失调是烧（创）伤后造成组织缺血再灌注损伤(Ischemia-Reperfusion Injury)的主要原因之一，是造成细胞损伤、死亡的常见现象[5,6]。
　　 近来研究表明，钙池可控性钙内流(Store-Operated Calcium (SOC) Eentry, SOCE)是许多非兴奋性细胞外钙离子内流的主要机制[7,9]。细胞膜蛋白，Orai1/CRACM1是SOC/CRAC 钙通道的核心成分，它对SOC/CRAC 钙通道活化起关键作用[10]。本课题组前期工作研究发现，细菌内毒素刺激血管内皮细胞SOC 钙通道蛋白如Orai1/CRACM1、STIM等表达增高，并诱导细胞钙内流，初步提示细菌内毒素对SOC钙通道活化及细胞钙内流存在某种未知的联系，但其机制尚不清楚。
　　 研究表明细菌内毒素LPS通过直接结合TLR4(Toll-Llike Receptor 4)和/或诱导核因子NF-κB 活化可导致人单核细胞株或原代单核细胞Btk 磷酸化[14]。Btk/Tec 激酶磷酸化后与磷脂酶C (Phospholipase C, PLC)一同调节持续的钙信号，即受体可控性钙离子内流(Recepter-Operated Calcium Entry, ROCE)。另有文献报道PLCγ蛋白也参与了SOC 钙通道的活化[15]。我们推断Orai1/CRACM1介导的SOCE 很可能与Btk/PLC 介导的ROCE在钙超载中存在协同作用。
　　 本课题拟在细胞和组织器官水平上，通过对内毒素诱导细胞及动物损伤模型的深入研究，探讨内毒素调控SOC 钙通道，调节细胞钙内流的作用方式，明确内毒素诱导血管内皮细胞钙超载损伤是否存在SOC 钙通道途径的新机制，以及明确SOC 钙通道与ROC 钙通道的协同关系，探索Orai1/CRACM1蛋白在内毒素诱导的细胞钙超载、脓毒症过程中的可能作用。
　　 为了说明上述问题，本论文分为四个部分进行论述：
　　 第一部分：内毒素诱导血管内皮细胞损伤模型研究，目的是证实本实验室前期的工作，为后续研究奠定基础。我们首先运用激光共聚焦、ELISA、免疫组织化学等实验检测内毒素诱导血管内皮细胞钙超载及凋亡，结果发现在一定剂量范围内，LPS 刺激细胞钙离子内流随剂量提高而升高，与0μg/ml组比较，1.0μg/ml LPS 刺激细胞钙离子内流强度最大（p<0.01），并且诱导24小时的细胞凋亡率最高，从而证实细胞钙稳态失调可导致细胞凋亡增加。其次，运用蛋白免疫印迹、RT-PCR等实验证实内毒素刺激血管内皮细胞可以诱导活化SOC 钙通道蛋白Orai1/CRACM1、STIM1。
　　 第二部分：我们在课题组之前工作的基础上，对内毒素诱导SOC 钙通道蛋白调节细胞钙内流的机制进行了深入研究。我们采用RNA 干扰技术(RNAi)，应用质粒载体介导的细胞内小干扰RNA(siRNA)表达策略，设计和构建了针对Orai1、STIM1siRNA表达载体siOrai1、siSTIM1，分别瞬时转染细胞，检测细胞内钙离子内流。
　　 Western blot及real-time RT-PCR的结果显示，人血管内皮细胞表达SOCE，LPS 诱导的血管内皮细胞内钙离子水平升高、钙超载及细胞凋亡可被Orai1/CRACM1和/或STIM1siRNA 所抑制。目标蛋白Orai1/CRACM1和STIM1调节血管内皮细胞钙离子流动。进一步研究，我们应用pcDNA3.0质粒载体介导细胞内目标蛋白过表达策略，设计和构建了针对Orai1/CRACM1的过表达载体转染细胞，检测细胞内钙离子内流，并通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。研究显示，LPS 刺激人血管内皮细胞SOC/CRAC 钙通道核心成分Orai1/CRACM1过表达后，细胞钙内流增强，凋亡显著升高(P<0.01)。上述结果说明Orai/CRACM1及STIM1对LPS 刺激细胞钙升高及细胞凋亡具有显著的调控作用。提示SOC 钙通道参与内毒素刺激引起的细胞外钙离子内流、钙超载及细胞凋亡。
　　 第三部分：Orai1/CRACM1介导的SOCE与Btk/PLC 介导的ROCE在钙超载中存在协同与关联。RT-PCR 结果显示Btk表达水平于LPS 刺激30min 开始升高，而6h 达峰值；而PLCγ的表达水平于LPS 刺激10min 开始升高，1h 达峰值。而转染Btk siRNA 可逆转TG、LPS 诱导的钙离子内流。磷酸化免疫共沉淀结果显示，LPS刺激Btk 磷酸化水平升高于6h 达峰值，而PLCγ磷酸化水平于LPS 刺激20min 达峰值。LPS 诱导的Btk、PLCγ磷酸化分别被Btk、PLCγ1的siRNAs 所抑制，而LPS诱导的细胞钙离子内流则分别减少了16.2％、25.7％；LPS 诱导的细胞凋亡分别降低了43.1％、27.3％。从而证实受体酪氨酸激酶Btk及其下游信号PLCγ参与LPS 诱导的钙流动及细胞凋亡调控。
　　 钙通道阻断实验结果显示，单独加入SOC 钙通道抑制剂2-APB （50μM）、PLC的抑制剂U73122 （10μM）、Btk的抑制剂LFM-A13 （20μM），LPS 诱导的细胞钙内流及细胞凋亡可被不同程度的减低。当细胞被内质网激动剂TG(2 μM)预先处理后，LPS对细胞外钙离子内流的效应被完全阻断。结果提示Orai1、STIM1介导的SOCE及Btk-PLCγ介导的ROCE 共同参与了内毒素诱导的细胞钙超载及细胞凋亡。
　　 免疫共沉淀结果显示，STIM1与PLCγ下游信号IP3内质网上的受体IP3R 之间存在着直接的相互作用。结果提示，SOC/CRAC 钙通道很可能通过STIM1、IP3R等途径与PLCγ介导的ROCE 钙信号相联系，在内毒素诱导的细胞钙超载和细胞凋亡过程中STIM1-IP3R 起了关键作用。
　　 第四部分：我们进行了动物实验。钙通道阻断的体内实验结果显示，LPS+2-APB组、LPS+U73122组均较单独LPS 刺激组小鼠肺损伤后其病理表现及细胞凋亡有所减轻。LPS 刺激后，加入2-APB （2mg/kg）、U73122 （30mg/kg）抑制剂，LPS 诱导的细胞凋亡可被不同程度的减轻。这些结果也进一步验证了体外实验的结论。
　　 通过上述研究，我们得出如下结论：1、初步证实人血管内皮细胞表达SOCE，Orai1/CRACM1和STIM1对LPS 刺激细胞钙升高及细胞凋亡具有显著的调控作用；
　　 2、受体酪氨酸激酶Btk及其下游信号PLCγ参与LPS 诱导的钙流动及细胞凋亡调控；
　　 3、Orai1、STIM1介导的SOCE及Btk-PLCγ介导的ROCE 共同参与了内毒素诱导的细胞钙超载及细胞凋亡。
　　 今后我们将针对Orai1在脓毒症中的作用及机制拟在此论文基础上运用基因敲除动物模型进一步深入研究。

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