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血小板TLR4在LPS诱导的肺微血管内皮细胞损伤中作用机制的体外研究

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论文说明：主要英文缩略词表

前言

第一部分小鼠肺微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

第二部分血小板在肺微血管内皮细胞损伤中的作用

第三部分血小板TLR4在肺微血管内皮细胞损伤中的作用

第四部分讨论

全文总结

综述：血小板和中性粒细胞在脓毒症中作用机制的研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢

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摘要

脓毒症（sepsis）是指各种致病微生物或其毒素存在于血液或组织中，机体对感染产生的一种严重全身性炎症反应，是外科感染、重度创伤、大手术后、重型急性胰腺炎和休克等的常见并发症，进一步加重可发展为严重脓毒症,并发感染性休克、急性肺损伤（acute lung injury，ALI）、急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distresssyndrome，ARDS）甚至多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。由革兰阴性杆菌的胞壁成份—脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的内毒素血症则为最常见最典型的脓毒症。肺脏是脓毒症时最易受损的器官，急性肺损伤出现最早，发生率最高，表现为低氧血症和呼吸窘迫。脓毒症是ALI 高发病率和高死亡率的主要原因。肺毛细血管通透性增高是脓毒症ALI的发病基础和重要的病理生理特征，肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endotheliAlcell，PMVEC）的损伤起着关键性作用。PMVEC呈连续性衬在血管腔内面，肺血管通透性依赖于其活性。
　　 越来越多的研究证明中性粒细胞和血小板积极参与脓毒症炎症反应并在其过程中发挥协同作用，包括血小板参与免疫激活及协同中性粒细胞诱捕细菌。TLR4（Tol llike receptor 4，TLR4）属于Tol l 样受体家族成员，表达于多种不同类型的细胞，为LPS刺激后启动促炎细胞因子的产生和相应的免疫反应，是LPS的特异性跨膜受体。近年来对内毒素血症中血小板活化机制的研究认为，脓毒症时血小板表达功能性TLR4，激活中性粒细胞形成中性粒细胞胞外菌网（neutrophil extracellular traps，NETs）捕获杀灭细菌；而血小板通过中性粒细胞依赖的方式首先聚集于肺毛细血管和肝血窦使血小板数量减少，进而导致肺和肝脏功能障碍甚至衰竭。
　　 脓毒症ALI时，PMVEC的损伤是由LPS的直接作用，还是由血小板与中性粒细胞的共同参与所致？血小板TLR4在此过程中发挥了怎样的作用？其他细胞的TLR4是否在PMVEC 损伤作用中亦起到重要的作用？这些方面的研究未见报道。
　　 研究目的:
　　 本研究通过LPS 刺激体外培养的小鼠PMVEC，观察血小板和（或）中性粒细胞对PMVEC 损伤的影响，探讨离体条件下血小板LPS 特异性受体TLR4对小鼠脓毒症ALI时PMVEC 损伤的介导作用；进而阐明血小板TLR4在脓毒症ALI时的作用，为脓毒症ALI 机制的深入研究提供实验依据。
　　 研究方法:
　　 1.原代培养小鼠肺微血管内皮细胞采用酶消化、免疫磁珠二次分选法分离纯化小鼠PMVEC，贴壁培养法体外扩增，CCK-8 法测定细胞的生长情况，相差显微镜观察培养细胞的形态，透射电子显微镜观察细胞的超微结构，流式细胞仪对其表型进行鉴定。
　　 2.分别分离正常小鼠和TLR4 缺失小鼠的血小板及正常小鼠的中性粒细胞血小板分离：小鼠异氟烷持续吸入麻醉后心脏穿刺以ACD （vol:vol 1:9）抗凝收集全血，约1.2～1.5ml/只，室温下1500rpm 离心5min，取上层富含血小板血浆再以3000rpm 离心10min，沉淀即为血小板。所得血小板活化程度通过流式细胞仪检测血小板表面CD41和CD62P/P-selectin的表达而测定，仅将未活化的血小板用于实验。
　　 中性粒细胞分离：ACD抗凝血用小鼠中性粒细胞分离液进行分离，所得中性粒细胞活化程度通过流式细胞仪检测其表面的Ly-6G和CD11b的表达而测定，仅将未活化的中性粒细胞用于实验。
　　 3.实验分组和处理取2～5代的PMVEC 以105/ml 接种于12孔板，5％ FBS，100U/100mg/ml 双抗DMEM，37 ℃ 5％ CO2培养2d 左右，待细胞85％～90％融合即可用于实验。将分离的血小板和中性粒细胞分别以终浓度约5×107/ml/孔和5×105/ml/孔与内皮细胞共培养。“血小板”部分，随机分为4组：对照组即内皮细胞组（E组）、内皮细胞+血小板组（EP组）、内皮细胞+中性粒细胞组（EN组）、内皮细胞+血小板+中性粒细胞组（EPN组）；“血小板TLR4 ”部分，随机分为2组：内皮细胞+血小板+中性粒细胞组（EPN组）和内皮细胞+TLR4 缺失血小板+中性粒细胞组（EP-/-N组）；每组分1h、6h、12h、18h、24h 5个亚组，每个亚组6孔，分别加入终浓度为1μg/ml的LPS，孵育。各亚组分别于第1、6、12、18和24h 收集上清液和内皮细胞待测。
　　 4.检测指标①原代培养内皮细胞鉴定：光镜观察细胞形态、电镜观察细胞超微结构、流式细胞仪测定细胞免疫表型、CCK-8 法测绘细胞生长曲线。②流式细胞仪测定分离的血小板和中性粒细胞免疫表型。③光镜观察各组内皮细胞处理后各个时间点的形态和数量改变。④DAPI 染色后荧光显微镜观察处理后24h 各组内皮细胞胞核变化。⑤流式细胞仪测定各组各个时间点内皮细胞数量、损伤率和活化率。⑥流式细胞仪测定上清液细胞数量及活化率。
　　 结论:
　　 1.建立了一种有效分离、纯化、扩增小鼠PMVEC的方法。
　　 2.血小板在离体LPS 诱导的小鼠PMVEC 损伤中与中性粒细胞协同作用，且两者缺一不可；P-selectin的表达不能作为离体条件下内毒素血症环境中血小板活化的特异性标志。
　　 3.血小板TLR4在离体LPS 诱导的小鼠PMVEC 损伤中促进内皮细胞、中性粒细胞的活化及血小板、中性粒细胞的粘附，加重炎症状态下中性粒细胞对PMVEC的损伤作用，即血小板TLR4与PMVEC的损伤密切相关。

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