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【6h】

RHBDD3抑制TLR触发的树突状细胞成熟及其抑制自身免疫性疾病发生的研究

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论文说明：缩略词表

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一、引言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

五、全文总结

参考文献

综述：免疫调控与自身免疫性疾病研究进展

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢

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摘要

免疫应答是一个高度复杂而受到严格调控的过程。机体一方面及时激发有效的免疫应答机制以清除有害病原微生物，另一方面，通过负向调节机制以控制免疫应答的适时、适度，维持自身耐受和内环境的稳定。作为专职性抗原提呈细胞，树突状细胞(dendritic cell，DC)在激活免疫应答以及维持免疫耐受中起着关键作用，但是，有关DC如何调控T细胞功能及其亚群分化发育的分子机制仍然不十分明了。DC表面表达多种模式识别受体包括Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)，可以识别病原微生物及其特定的组分而启动天然免疫应答。然而，TLR通路过度活化或者活化异常可能引起急性和慢性疾病，如中毒性休克、自身免疫病等。因此，TLR触发的免疫应答过程受到精确调控，但目前对于TLR通路负向调控分子机制的研究尚不深入。此外，机体内是否还存在目前尚未发现并起重要作用的TLR通路负向调控分子?其与已经发现的相互之间的联系如何?这些悬而未决的科学问题的进一步深入探索对于免疫识别与免疫应答调控的研究具有很大的理论意义，对于免疫相关性疾病的防治也具有实际应用价值。
　　 RHBDD(Rhomboid domain-containing protein)为含有Rhomboid结构域的一类蛋白质。目前已经克隆出的Rhbdd基因成员包括Rhbdd1、Rhbdd2和Rhbdd3。RHBDD3首先在对垂体瘤中的基因甲基化筛选中被分离和鉴定出来，并被称为垂体瘤凋亡基因(pituitary tumor apoptosis gene，PTAG)。Rhbdd3是人类RHBDD3在小鼠中的同源基因，定位于11号染色体，编码385个氨基酸。预测发现RHBDD3蛋白分子N末端为信号序列，其后为四个跨膜结构域，C末端包含一个UBA结构域。复旦大学发育生物学研究所制备了Rhbdd3-/-小鼠。前期观察表明，老龄Rhbdd3-/-小鼠出现自身免疫性疾病病理表现，在此基础上，我们于本实验中从DC、T细胞亚群以及TLR触发DC成熟和细胞因子产生与机制的角度，对于RHBDD3如何负向调控免疫应答和抑制自身免疫性疾病发生发展的机制与意义进行了以下研究。
　　 1.RHBDD3能够显著抑制DC的成熟与功能及TLR触发的炎性细胞因子(IL-6、TNF-α)的产生
　　 首先，我们观察了Rhbdd3-/-小鼠骨髓来源DC(BMDC)及其对TLR激动剂刺激的反应性。实验发现Rhbdd3-/-BMDC在表型上较同窝野生型BMDC成熟得更早，在体外GM-CSF及IL-4诱导至五天即表现出I-Ab、CD40、CD80、CD86表达水平显著升高，至第七天与对照BMDC的表型趋于一致。在LPS(TLR4配体)、CpG(TLR9配体)以及Poly(I∶C)(TLR3配体)体外刺激后，Rhbdd3-/-BMDC分泌更高水平的IL-6和TNF-α，而IFN-β的产生与对照相比无明显差异。Rhbdd3-/-BMDC能够更显著地促进抗原特异性CD4+T细胞增殖，并诱导其优势分化为分泌IFN-γ的Th1和分泌IL-17的Th17。应用携带Rhbdd3基因的慢病毒载体转染小鼠BMDC，发现在DC内过表达Rhbdd3之后DC表型成熟受到明显抑制，DC对LPS刺激的反应也受到明显抑制，表现为炎症因子分泌显著降低；采用Rhbdd3慢病毒载体转染Rhbdd3-/-BMDC，则能够显著抑制其过度活化及炎性细胞因子分泌。以上体外实验表明RHBDD3分子能够负向调控DC的体外成熟并抑制其对TLR激动剂的反应性，从而显著抑制DC刺激抗原特异性T细胞增殖及促进Th1和Th17诱导分化的功能。
　　 我们进一步观察了RHBDD3对于脾脏cDC的成熟与功能的影响。Rhbdd3-/-小鼠脾脏CDllc+cDC组成性表达更高水平的I-Ab，在TLR激动剂刺激下，脾CDllc+cDC产生更多的IL-6、TNF-α；并能更有效地促进T细胞增殖及诱导分泌IFN-γ的Th1和分泌IL-17的Th17分化。与野生型小鼠相比，Rhbdd3-/-小鼠在体内注射LPS刺激后产生更高水平的IL-6和TNF-α。体内外实验表明RHBDD3分子是一个能够显著抑制DC成熟活化及TLR触发的炎症反应的负向调控分子，也提示其能够抑制DC介导的Th1、Th17分化。
　　 2.RHBDD3通过抑制DC产生IL-6而参与调控体内不同T细胞亚群的分化，即促进了Treg的产生而抑制了Th1和Th17分化
　　 我们进一步分析了Rhbdd3-/-小鼠体内的T细胞亚群及其功能。通过检测Rhbdd3-/-小鼠脾脏及肠系膜淋巴结的Treg及T细胞亚群分化水平，发现Rhbdd3-/-小鼠的脾脏、肠系膜淋巴结细胞CD4+CD25+Treg及CD4+Foxp3+Treg比例明显下降；CD3/CD28活化的Rhbdd3-/-CD4+T细胞产生更高水平的IFN-γ以及IL-17，提示Rhbdd3-/-小鼠体内的T细胞中Th1和Th17的比例上调。体内注射LPS刺激后Rhbdd3-/-小鼠产生更高水平的IFN-γ以及IL-17。结果表明RHBDD3促进了Treg产生并抑制了Th1、Th17分化。
　　 我们进一步研究了Rhbdd3-/-小鼠体内T细胞亚群的变化是否源于DC过度成熟与活化。据文献报道IL-6能够抑制Treg产生但促进Th17的分化。于是我们推测Rhbdd3-/-小鼠体内升高的IL-6可能是其体内T细胞亚群分化紊乱的关键性分子。我们用Rhbdd3-/-小鼠与Il6-/-矿-杂交得到了Rhbdd3-/-Il6-/-小鼠，结果发现，与Rhbdd3-/-Il6-/-严+小鼠BMDC相比，Rhbdd3-/-Il6-/-小鼠BMDC在体外诱导T细胞增殖及诱导Th1和Th17的分化功能明显降低，而且，与Rhbdd3-/-Il6+/+小鼠相比，Rhbdd3-/-Il6-/-小鼠体内Treg比例明显回升，Th1、Th17比例明显下降。以上结果表明RHBDD3分子通过抑制DC来源IL-6的产生，调节了体内Treg与Th1和Th17的平衡。
　　 3.RHBDD3通过其UBA结构域与IKKγ相互作用而抑制LPS诱导的NF-κB活化
　　 我们进一步探讨了RHBDD3分子的亚细胞定位及其抑制TLR介导的炎性因子的产生的分子机制。我们发现LPS刺激后Rhbdd3-/-DC的NF-κB途径过度活化，IKKα/β及IκBα磷酸化明显增强，NF-κB的p65亚基入核明显增加。相反，IRF-3途径激活无明显差异，p-JNK、p-ERK、p-p38表达亦无明显差异。在293细胞中过表达RHBDD3分子明显抑制TNF-α诱导的NF-κB途径活化。进一步实验证实RHBDD3在LPS刺激后的细胞中定位于早期内体，与IKKγ共定位且发生相互作用，这种相互作用于依赖于RHBDD3的UBA结构域。这提示RHBDD3分子可以抑制LPS诱导的NF-κB活化，并通过其UBA结构域与IKKγ相互作用，该结果为RHBDD3如何抑制DC分泌IL-6提供了机制解释。
　　 4.RHBDD3能够通过抑制IL-6体内产生而显著抑制自身免疫性疾病IBD和EAE的发生发展
　　 研究表明，Th1和Th17在炎性肠病IBD和实验性脑脊髓炎EAE中发挥重要的致病作用，而Treg在上述两种自身免疫性疾病的发生中起抑制作用。因此，我们建立了TNBS诱导的IBD小鼠模型以及MOG肽诱导的EAE小鼠模型，观察到Rhbdd3-/-小鼠比野生型小鼠表现出更高的发病率以及更严重的症状和病理损伤，包括IBD小鼠体重下降更为显著，病理损害更为严重，而EAE小鼠的临床评分及发病率都显著升高。进一步研究发现，TNBS诱导IBD发病的Rhbdd3-/-小鼠脾脏DC表达更高水平的I-Ab、CD40、CD80、CD86，T细胞表达更高的活化分子CD44。表明RHBDD3控制机体避免发生过度的免疫应答、防止自身免疫性疾病的发生具有重要意义。
　　 可见，RHBDD3能够通过控制DC成熟及抑制TLR触发的NF-κB信号通路活化，抑制IL-6等炎症因子的释放，维持了Tκeg的水平，并抑制了Th1和Th17的过度活化，进而在整体水平上抑制了自身免疫性疾病的发生与组织侵害。
　　 总之，通过本项研究，我们首次确认了RHBDD3分子是一个全新的TLR信号途径的负向调控蛋白分子，是一个能够显著抑制自身免疫性疾病发生的效应分子。本课题从一个全新的角度展示了DC成熟及TLR信号通路的调控机制，丰富了自身免疫性疾病发生发展分子机制的认识，为自身免疫性疾病的治疗提供了可能的靶点，对于自身免疫性疾病的新型治疗方法的设计与探索提供了新的思路与依据。

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