神经再支配对长期失神经喉面肌成肌干细胞功能的影响

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目的：研究失神经及神经再支配对大鼠面肌和长期失神经人喉肌成肌干细胞的作用，探讨失神经不同时期喉面肌的再生能力。方法①将SD大鼠随机分为面神经损伤组、神经损伤8周及损伤16周减压组和正常对照组。②按病程将人环杓后肌标本分为失神经6-12月、13-24月组、25-36月、＞36月组和正常对照组。采用双重免疫荧光标记不同状态卫星细胞，real-time PCR和Western blot分别检测myoD、myogenin的转录和蛋白水平。结果①大鼠面肌失神经3周后myoD(+)和myogenin(+)卫星细胞和胚胎型肌球蛋白eMyHC(+)肌纤维增多，6周达到峰值后逐渐减少。失神经28周面肌未检测到静息态卫星细胞。神经损伤2-12周myoD和myogenin表达上调且6-8周出现峰值，正常组和失神经＞12周蛋白表达阴性。②神经减压后4周可见myoD(+)、myogenin(+)细胞和eMyHC(+)肌纤维，成肌调节因子表达上调并持续4周。神经损伤8周和16周后神经减压组比较，前者激活卫星细胞数目多，且成肌调节因子表达上调幅度高(p＜0.05)。⑨只有失神经6-12月人喉肌可见myoD(+)、myogenin(+)细胞和少量eMyHC(+)肌纤维，且表达水平最高。正常和损伤＞25月组myoD和myogenin蛋白表达阴性。结论失神经后喉面肌卫星细胞激活参与肌肉再生，但长期失神经后卫星细胞减少甚至耗竭导致再生能力下降。适时延期神经再支配可再次激活卫星细胞而启动成肌进程。神经再支配越早，肌肉再生能力越强。人喉肌失神经2年内仍有较好的神经、肌肉再生基础。喉、面神经损伤可造成不同程度的发音、呼吸、吞咽及面肌功能障碍。骨骼肌再生依赖于成肌干细胞，肌卫星细胞是成体骨骼肌再中最基本的成肌干细胞。接受损伤刺激后，正常位于基底膜和肌浆膜之间的静息态卫星细胞被激活，增殖、分化为成朋细胞参与肌肉再生进程。长期失神经导致卫星细胞减少甚至耗竭，严重影响肌肉再生能力。虽然神经修复能恢复肌肉不同程度的功能，并且修复时间越早，功能恢复越好，但临床所遇到的往往是喉、面肌长期失神经支配，其再生潜力如何以及能获得满意功能恢复的晚期神经修复时限尚不清楚，神经修复对萎缩纤维化的骨骼肌作用及机制也不完全清楚。因此，本实验拟建立大鼠面肌失神经及晚期神经再支配的模型以及收集长期失神经人环杓后肌标本，通过失神经不同时间及神经修复再支配后的成肌干细胞功能状态及成肌调节因子的基因、蛋白表达水平时空改变和失神经不同时期的喉面朋再生能力的研究，探讨晚期神经再支配对成肌干细胞增殖、分化、融合形成新的肌纤维或与损伤的肌纤维融合的作用，以及失神经时限对喉面肌再生能力的影响。研究结果旨在揭示神经再支配对喉面肌成肌干细胞功能的作用及可能机制，为临床晚期神经修复时限的选择提供理论依据，有助于进一步深入研究失神经及神经再支配对成肌干细胞功能的调控机制。本研究共分为四个部分：第一部分大鼠面肌失神经及神经再支配模型的建立。目的：研究面神经损伤及神经再支配后面肌功能、组织形态学改变，建立可逆性和不可逆面肌功能恢复的动物模型。方法：240只雄性SD大鼠随机分为面神经结扎组(n=110)、损伤8周减压组(n=60)、损伤16周减压组(n=60)和正常对照组(n=10)。采用面神经结扎和结扎后8周、16周分别减压。结扎术后及晚期减压术后每日观察面肌功能恢复情况；诱发肌电图测量面肌最大诱发电位和潜伏期；处死动物后取口轮匝肌和结扎处远段面神经，Masson三色法检测单位面积内肌纤维数目和平均直径，甲苯胺蓝染色检测面神经单位面积内有髓纤维数目。结果：神经结扎导致损伤侧面肌瘫痪，神经损伤8周减压组面肌功能恢复接近于正常，而损伤16周减压组功能恢复较差。损伤8周减压组面肌最大诱发电位幅度可恢复至正常水平的75.55％，而损伤16周减压组仅为26.21％。损伤8周减压组面神经单位面积内有髓纤维数目、肌纤维数目和平均直径分别为正常值的72.26％(p＜0.05)、95.2％(p＞0.05)和93.79％(p＞0.05)，而损伤16周减压组仅为36.65％(p＜0.05)、69.33％(p＜0.05)和72.77％(p＜0.05)。结论：采用面神经结扎和减压可建立一种可靠和稳定的神经损伤后面肌再生模型。早期神经减压，大部分神经纤维可再生支配肌肉，恢复满意的面肌功能。尽管晚期神经减压仍可使得肌肉得到部分神经再支配，但功能恢复明显减退。神经修复的时间是影响失神经面肌功能恢复程度的重要因素。第二部分失神经及神经再支配对大鼠面肌成肌干细胞影响的形态学研究。目的：探讨失神经和晚期神经再支配对成肌干细胞增殖、分化、融合形成新的肌纤维或与损伤的肌纤维融合的作用。方法：实验分组同前。双重免疫荧光法采用Pax7、myoD、myogenin和eMyHC分别标记的不同功能状态卫星细胞或/和再生肌纤维，以及laminin标记基底膜。图像分析检测各组单位面积内阳性细胞或肌纤维数。结果：正常面肌可见少量Pax7阳性细胞，神经损伤28周组中未检测到Pax7阳性细胞。神经损伤后2周出现myoD阳性细胞，6周后消失。神经损伤后4-12周检测到myogenin阳性细胞以及大量eMyHC阳性肌纤维，其中伤后6周组数目最多。损伤8周减压后4周再次出现myoD阳性细胞，而减压后8周内均见myogenin阳性细胞和eMyHC阳性肌纤维。损伤16周减压4-8周内见少量myoD阳性细胞数和eMyHC阳性肌纤维，其中一部分肌纤维缺失基底膜包绕。结论：晚期面神经修复可激活残存的卫星细胞增殖、分化，形成新生纤维或直接修复损伤的肌纤维。失神经病程决定面肌中成肌干细胞(卫星细胞)的再生能力。神经再支配越早，面肌中成肌干细胞的再生能力越强，面肌再生程度越好。第三部分失神经及神经再支配对大鼠面肌成肌干细胞相关调控因子影响的定量研究。目的：探讨失神经和神经再支配对面肌成肌调节因子表达的影响。方法：实验分组同前，采用real-time PCR和Western blot分别检测myoD、myogenin的转录和蛋白水平。结果：失神经后2周myoD和myogenin的转录水平上调，6周达到峰值后逐渐降低。损伤8周减压后4周再次表达上调并维持8周后降至正常对照水平，损伤16周减压组上调幅度明显低于前者。正常面肌myoD和myogenin蛋白表达阴性，伤后2周和4周方可分别检测到myoD和myogenin阳性表达，6周表达水平最高，8周后未检测到myoD阳性条带。损伤8周减压后4周myoD蛋白水平再次上调，并维持4周左右；而myogenin蛋白水平在减压后4-6周表达最高，减压后12周表达阴性。神经损伤16周减压的面肌中myoD和myogenin蛋白水平改变的规律与损伤8周减压相似，但上调幅度明显低于前者(p＜0.05)。结论：晚期面神经修复可能通过激活卫星细胞上调成肌调节因子的表达。病程越早，上调水平越高，肌肉成肌再生能力越强。当面肌完成神经再支配后，成肌调节因子表达受抑制，从而完成肌肉的再生。第四部分长期失神经支配人喉肌成肌干细胞功能调控的研究。目的：研究长期失神经人环杓后肌中卫星细胞和成肌调节因子的表达改变，探讨失神经病程对喉肌再生能力的影响。方法：将58例人环杓后肌标本按病程分为四组失神经6-12月组(n=15)，失神经13-24月组(n=17)，失神经25-36月组(n=14)，失神经＞36月组(n=12)，正常环杓后肌为对照组(n=8)。采用双重免疫荧光标记检测不同状态卫星细胞，real-time PCR、Western-blot检测肌肉成肌调节因子myoD、myogenin的转录和蛋白水平。结果：正常喉肌内可见少量Pax7阳性细胞，损伤组均未检测到Pax7阳性细胞。只有损伤6-12月组可检测到myoD和myogenin阳性细胞，部分肌纤维核亦表达myoD。损伤6-12月和13-24月组均见eMyHC阳性肌纤维。定量分析显示损伤6-12和13-24月组myoD和myogenin的转录和蛋白水平高于正常，有统计学差异(p＜0.05)，而其他各组蛋白表达阴性。结论：人喉返神经损伤后喉肌中卫星细胞被激活，其通过分化、融合参与肌肉再生。病程越短，喉肌再生能力越强。失神经2年内成肌调节因子表达水平处于上调状态，喉肌仍具有较大再生潜力，而失神经2年以上喉肌再生能力明显下降，因此提示延期神经修复在2年以内进行，仍有较好的神经、肌肉再生基础。全文结论：神经修复的时间是影响失神经面肌功能恢复程度的重要因素。失神经病程决定面肌卫星细胞的再生能力。面神经修复可激活残存的卫星细胞进入成肌进程而完成肌肉的再生，但确切作用机制尚不清楚。神经再支配越早，卫星细胞的再生能力越强，面肌再生程度越好。失神经2年内的人喉肌仍有较好的神经、肌肉再生基础。

著录项

作者
陈东辉;
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作者单位

第二军医大学;

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授予单位第二军医大学;
学科耳鼻咽喉科学
授予学位博士
导师姓名郑宏良;
年度 2009
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类喉神经系疾病;
关键词
成肌干细胞; 失神经; 神经再支配; 骨骼肌再生; 成肌调节因子;

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