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基于壳聚糖季铵盐-精氨酸聚合物载体的DNA纳米复合物提高体内外基因转染功效

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摘要

前言

1 仪器和材料

1．1 材料与试剂

1．2 仪器

1．3 细胞株与动物

2 实验方法

2．1 壳聚糖季铵盐-精氨酸共聚物(TMC-Arg)的制备与表征

2．1．1 壳聚糖季铵盐(TMC)的制备

2．1．2 TMC-Arg的制备

2．1．3 1H NMR

2．2 纳米复合物的制备

2．3 粒径和Zeta电势

2．4 凝胶阻滞

2．5 核酶抑制和血清稳定性

2．6 抗稀释和离子强度稳定性

2．7 细胞毒性

2．8 细胞黏附

2．9 细胞摄取

2．9．1 FITC标记pEGFP

2．9．2 蛋白含量标准曲线(Lowry法)

2．9．3 细胞摄取

2．10 细胞摄取机制

2．11 TMC-Arg与pEGFP结合力

2．11．1 肝素钠解离

2．11．2 EB排阻

2．12 pEGFP体外释放

2．13 核质分布

2．14 体外转染

2．15 体内转染

2．15．1 体内转染定量测定

2．15．2 荧光显微镜观察

3 结果与讨论

3．1 TMC-Arg的制备与表征

3．2 纳米复合物的制备与表征

3．3 凝胶阻滞

3．4 核酶抑制和血清稳定性

3．5 抗稀释和离子强度稳定性

3．6 细胞毒性

3．7 细胞黏附

3．8 细胞摄取

3．8．1 蛋白含量标准曲线

3．8．2 细胞摄取

3．9 细胞摄取机制

3．10 TMC-Arg与pEGFP结合力

3．10．1 肝素钠解离

3．10．2 EB排阻

3．11 pEGFP体外释放

3．12 核质分布

3．13 体外转染

3．14 体内转染

总结与展望

参考文献

致谢

个人简历

阳离子聚合物类DNA递送载体

声明

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摘要

外源基因需借助载体的递送方可发挥功效。壳聚糖生物相容、生物可降解、安全性好，可包载质粒DNA(pDNA)形成纳米复合物，介导体内外基因转染。但壳聚糖/pDNA纳米复合物中性条件下稳定性差，胞内难以解离，转染效率低，需对壳聚糖进行功能化修饰以提高转染效率。DNA纳米复合物在递送过程中需克服影响转染效率的一系列体内外屏障，解析相关机制有助于合理设计递送载体，实现外源基因的体内外高效和稳定表达。
　　壳聚糖经季胺化修饰及精氨酸（Arg）接枝，得到壳聚糖季铵盐-精氨酸共聚物（TMC-Arg）。以TMC-Arg为阳离子聚合物载体，增强型绿色荧光蛋白表达质粒(pEGFP)为模式质粒，制备纳米复合物(TANC)，考察其体外转染效率及接枝Arg后转染效率提高的可能机理;通过加入不同比例的阴离子交联剂三聚磷酸钠(TPP)和γ-聚谷氨酸(γ-PGA)至TANC，研究交联剂的组成对纳米复合物体内外转染效率的影响。
　　制备四种不同TPP与γ-PGA比例的TANC，分别命名为TANC1、TANC2、TANC3和TANC4。TMC/pEGFP纳米复合物(TNC)与TANC的粒径均为100-150nm，电势均为20-30 mV，TANC的电势随交联剂组成中TPP含量的上升而下降。TNC和TANC均能有效缩合pEGFP，保护pEGFP免遭核酶降解。TANC在高离子强度及稀释倍数条件下可保持纳米复合物原有的结构，稳定性优于TNC。考察纳米复合物在HEK293细胞的黏附和摄取，表明TNC和TANC均能有效黏附至细胞表面;接枝Arg可促进纳米复合物的细胞摄取，不含交联剂的TANC1的细胞摄取量是TNC的2.1倍;交联剂组成不同的TANC的细胞摄取水平随TPP含量的上升而下降。加入内吞抑制剂考察纳米复合物的入胞途径，结果表明TNC主要经网格蛋白介导的内吞途径入胞;不含交联剂的TANC1和只含TPP的TANC4经网格蛋白介导的内吞途径入胞;含γ-PGA的TANC2和TANC3可经小窝蛋白介导的内吞途径入胞。考察交联剂的组成对TANC中pEGFP体外释放的影响，可见pEGFP的释放速率和累积释放量随TPP含量的上升而增加，表明TMC-Arg与pEGFP的结合力随TPP含量的上升而减弱。核质分布试验结果表明TNC和TANC均可有效递送pEGFP至细胞核;接枝Arg可显著提高pEGFP在细胞核的分布，12 h时TANC1中pEGFP在细胞核的分布是TNC的1.3倍;交联剂的组成可影响TANC中pEGFP于不同时间在细胞核的分布，细胞核中分布达到峰值的时间随TANC释放速率的增加而缩短。考察TNC和TANC在HEK293细胞体外转染24、48、72和96 h的效率，Arg修饰可显著提高纳米复合物的体外转染效率，96 h时TANC1的转染效率是TNC的1.3倍;交联剂的组成可影响TANC的体外转染效率，TANC3在48 h的转染效率为35.1％，显著高于TANC1、TANC2和TANC4;在96 h的转染时程内，TANC1的转染效率随时间延长而增加，而TANC2、TANC3和TANC4的转染效率分别于72 h、48 h和24 h达到峰值。小鼠胫前肌肌肉注射TANC考察其体内转染功效，结果表明，3天时TANC3组小鼠的肌肉组织中绿色荧光蛋白(GFP)表达量最高，分别为TANC1、TANC2、TANC4和Lipofectamine2000/pEGFP纳米复合物的2.6倍、1.7倍、3.9倍和3.2倍;7天时TANC1和TANC2组小鼠肌肉组织中GFP表达量分别为其3天时的2.2倍和1.5倍。

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