PB转座子和To12转座子介导基因长期表达的研究

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第—部分量化检测SEAP报告基因方法的探索
　　目前对SEAP报告基因的检测普遍是通过检测SEAP反应吸光值的方法来进行的，然而，由于吸光值检测会受到实验条件等因素的影响，所以，不同实验室对SEAP检测的结果很难进行比较分析，限制了SEAP报告基因的应用。因此，十分需要建立一种对SEAP基因的表达量进行定量检测的方法。
　　我们建立了一种可以在不同实验条件下，通过检测SEAP反应的吸光值计算出SEAP蛋白质量的方法，对SEAP检测的实验结果可以进行准确的比较分析，为SEAP报告基因更好的应用于科学研究中提供了支持。
　　方法:
　　通过建立SEAP反应产物对硝基苯酚的标准曲线，根据Lambert-Beer定律:A=ε×c×d，计算出我们实验条件下的对硝基苯酚的摩尔消光系数，结合SEAP酶的比活，进而推导出SEAP反应吸光值与SEAP质量之间的关系式，可以应用于检测细胞上清和小鼠血清中SEAP的表达量。
　　结果:
　　建立了一种可以应用于在不同实验条件下，通过检测SEAP反应的吸光值计算出SEAP蛋白质量的方法。推导出在我们的实验条件下，待测样品中SEAP浓度（μg·L-1）的计算公式为:c=△A/min×33.35×稀释倍数，所以，SEAP蛋白质量（μg）的计算公式为:m=△A/min×33.35×稀释倍数×样品体积。我们将得到的公式成功的应用于细胞上清和小鼠血清中SEAP量的检测。在小鼠尾静脉快冲实验中，检测到小鼠体内SEAP的表达量随着时间的推移逐渐降低。
　　结论:
　　我们建立了一种可以将SEAP检测从对吸光值的比较上升到可进行量化比较的方法，并且该方法能够应用于不同实验的条件，为SEAP报告基因更好的应用提供了支持。
　　第二部分 PB转座子和Tol2转座子介导基因长期表达作用的初步探索
　　转座子(Transposon)是一类相对独立的DNA片段，能够在宿主基因组中通过“剪切和粘贴”的机制发生位置的移动，其移动位置的过程称为转座(Transposition)。由于具有转座的功能，转座子作为一种分子遗传学工具被广泛的应用于转基因和插入突变等研究中，转座子现在已成为生命科学研究中的一个热点。
　　使用病毒载体可以使基因有效地整合到基因组中，但是病毒载体存在可携带的DNA片段较小和制作成本较高等问题，限制了病毒载体的使用。转座子同样具有促进基因整合到基因组中并实现整合基因长期表达的功能，同时，使用转座子系统仅需将质粒导入细胞中即可发挥转座作用，而且转座子还具有DNA运载容量大和制作成本低等优点。我们选择了应用比较广泛的Tol2转座子和piggyBac(PB)转座子作为实验材料，在CHO细胞和HEK293T细胞中对转座子介导基因长期表达的情况进行了探索，为转座子系统应用于基因长期表达的研究提供了支持。
　　方法:
　　我们首先在CHO细胞中用带有荧光蛋白表达框架的PB转座子和Tol2转座子进行了转染实验，在转染后不同的时间点，通过用荧光显微镜观察荧光蛋白表达量的变化情况，探索了转座子介导荧光蛋白基因长期表达的情况。接着，我们采用了可以进行定量比较的SEAP报告基因在HEK293T细胞和CHO细胞中进行了转座子的转染实验，在转染后不同的时间点，通过采集细胞培养上清进行SEAP表达量的实时检测，探索了转座子介导SEAP基因长期表达的情况。
　　结果:
　　用PB转座子和Tol2转座子转染CHO细胞后，用荧光显微镜观察到转座子能够介导荧光蛋白持续表达超过一个月。PB转座子和Tol2转座子转染HEK293T细胞和CHO细胞后，跟踪检测SEAP报告基因表达量的变化情况，发现转座子能够介导SEAP蛋白可以长期的表达。同时发现PB转座子介导基因长期表达的效果优于Tol2转座子。
　　结论:
　　通过转座子系统转染CHO细胞和HEK293T细胞的实验，证明了转座子可以介导基因长期的表达，为转座子系统应用于基因长期表达的研究提供了支持。

著录项

作者
李国保;
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作者单位

复旦大学;

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授予单位复旦大学;
学科生物工程
授予学位硕士
导师姓名卢大儒;
年度 2011
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类病理生理学;
关键词
PB转座子; Tol2转座子; 基因长期表达; SEAP基因;

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