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组织因子途径抑制物2在ACS患者循环中的水平及其对血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响及机制研究

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摘要

动脉粥样硬化是当今社会的最主要致死、致残性疾病。据估计,到2020年,心血管疾病尤其是动脉粥样硬化将成为全球疾病负担的最主要原因。研究表明,其发病机制为:各种危险因素引起的血管内皮损伤、平滑肌细胞迁移、脂质积聚、脂质斑块形成、破裂,继而引起临床心脑血管事件。
　　组织因子途径抑制物2(Tissuefactorpathwayinhibitor-2,TFPI-2),是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。体外研究表明,TFPI-2可抑制多种基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinase,MMPs)的活性。众所周知,MMPs在动脉粥样硬化的发生发展中发挥重要作用,一方面可诱导血管平滑肌细胞(Vascularsmoothmuscleceils,VSMCs)由血管中膜向内膜的迁移,并促进其增殖导致斑块增大:另一方面,MMPs又可不断降解细胞外基质(extracellularmatrix,ECM),导致粥样硬化斑块不稳定。研究表明,动脉粥样硬化过程中,在各种炎症因子及血流切应力的刺激下,MMPs过度活化,导致细胞外基质合成和降解的失平衡,继而引起斑块不稳定,而不稳定的斑块正是急性冠脉综合征(acutecoronarysyndrome,ACS)的发病基础之一。本研究正是基于目前的一些研究结果,推测TFPI-2在急性冠脉综合征患者中的血浆中的水平可能与稳定性冠心病患者不同,可能与粥样硬化斑块不稳定相关。
　　鉴于在临床研究中我们发现:TFPI-2在急性冠脉综合征患者外周血浆中水平较低,且在动物预实验中发现易损斑块肩部TFPI-2表达量低,并与MMPs呈负相关。我们推测TFPI-2的表达不足可能是动脉粥样硬化斑块发生发展的病理生理基础之一。为了进一步研究TFPI-2在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)中的作用,我们以AS的重要细胞组分——血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)为研究对象,以外源性ox-LDL干预模拟AS微环境,构建TFPI-2过表达以及下调的病毒载体,研究TFPI-2对AS过程中平滑肌细胞表型及功能的调节作用及其可能机制。
　　第一部分，急性冠脉综合征患者血浆组织因子途径抑制物2的水平
　　[目的]：
　　检测急性冠脉综合征患者与稳定型心绞痛及健康对照组患者外周循环TFPI-2、MMP-1,-3和-9水平。分析ACS患者与稳定型心绞痛及健康对照组患者循环中TFPI-2、MMP-1,-3和-9的差异及其相关性。
　　[方法]：
　　连续入选拟诊“冠心病”入我科并行冠脉造影检查的患者。造影前采集患者外周静脉血,离心后取血浆分装后保存于深低温冰箱待测,并收集患者临床资料及用药信息。采用ELISA试剂盒检测血浆TFPI-2、MMP-1、MMP-3及MMP-9的浓度,SPSS15．0统计软件分析结果。
　　[结果]：
　　本研究共纳入180名忠者,全部接受冠脉造影检查,包括109名ACS患者,41名稳定型心绞痛患者及30名造影阴性的对照者。各组患者在年龄、性别、糖尿病、高血压、吸烟、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯等方面并无显著差异,但急性冠脉综合征组的高密度脂蛋白胆固醇、左室射血分数较另外两组为低,而血清肌酐、高敏C反应蛋白及NT-pro-BNP较另两组为高。ACS组患者更多地使用了他汀类药物。与其他两组相比,ACS组血浆TFPI-2的水平明显降低,而稳定型冠心病组与造影阴性组血浆。TFPI-2浓度并无显著性差异。相反,与其他两组相比,ACS组有更高的MMP-1的水平。相关性分析结果显示,血浆MMP-1水平与TFPI-2水平呈负相关(r=-0．338,P<0．01)。研究并未发现各组问MMP-3,9血浆浓度的差异。研究中以急性冠脉综合征为因变量,以各临床因素及血浆TFPI-2、MMP-1浓度为自变量进行多元Logistic回归分析,结果显示,在矫正了其他因素之后,低TFPI-2血浆浓度是ACS独立预测因子。
　　[结论]：
　　本研究发现ACS患者的血浆TFPI-2水平较稳定型冠心病及造影阴性者明显降低,与MMP-1呈负相关。提示TFPI-2的分泌不足可能与ACS的发病相关。
　　第二部分，TFPI-2对血管平滑肌细胞增殖、凋亡及迁移的影响
　　[目的]：研究组织因子途径抑制物2(TFPI-2)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞增殖、凋亡及迁移的影响。
　　[方法]：体外培养人血管平滑肌细胞(VSMCs),构建过表达人TFPI-2基因的逆转录病毒Retro-TFPI-2以及下调人TFPI-2基因的慢病毒载体RNAi-TFPI-2,以不含TFPI-2基因的空病毒载体(Retro-control和RNAi-control),作为对照,感染VSMCs。感染后48小时,用40μg/mlox-LDL干预,采用CCK-8试剂盒检测各组细胞各时间点的增殖情况,PI/AnnexinV-FITC双染流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell小室法及划痕法检测细胞迁移情况。
　　[结果]：realtimePCR及WestemBlot结果证实病毒感染可成功上调、下调TFPI-2表达。CCK-8检测发现,TFPI-2过表达可显著抑制VSMCs的增殖(P<0．01)。Transwell及划痕实验结果发现TFPI-2过表达可抑制VSMCs的迁移。TFPI-2下调后对VSMCs增殖及迁移的影响与过表达情况相反。流式细胞仪检测TFPI-2过表达或下调对VSMCs的凋亡无显著影响。
　　[结论]：TFPI-2可抑制VSMCs的增殖及迁移,对VSMCs的凋亡无显著影响。
　　第三部分，TFPI-2影响血管平滑肌细胞功能的机制探讨
　　[目的]：研究调节TFPI-2水平对OX-LDL诱导的人VSMCs增殖、迁移影响的可能机制。
　　[方法]：体外培养人VSMCs,构建上调、下调TFPI-2的病毒载体,感染VSMCs。上调、下调TFPI-2后,明胶酶谱法检测VSMCs分泌的MMP-2,9的活性。Westernblot方法检测细胞周期蛋白cyclinD1的表达以及磷酸化细胞外信号调节激酶1/2
　　(extracellularsignal-regulatedkinase1/2,ERK1/2)、丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threoninekinase,Akt)、信号转导和转录激活子3(signaltransducersandactivatorsoftranscription3,STAT3)、黏着斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)蛋白的表达情况。
　　[结果]：上调TFPI-2可抑制ox-LDL诱导的MMP-2,9的活性,可抑制细胞周期蛋白cyclinD1的表达,可使人VSMCs的Akt、STAT3、FAK通路磷酸化水平受抑制,对人VSMCs的ERK1/2通路磷酸化无明显影响。下调TFPI-2后作用相反。
　　[结论]：TFPI-2可抑制人VSMCs的增殖、迁移能力。可能与其作为丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制MMP-2,9的活性相关,也可能通过对细胞周期蛋白cyclinD1及细胞增殖、迁移相关信号转导通路Akt、FAK、STAT3磷酸化的抑制。

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