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促红细胞生成素与模型小鼠早产儿视网膜病变相关性的实验研究

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前言

第一部分 氧诱导视网膜病变小鼠模型的建立

材料与方法

结果

讨论

附图

第二部分 促红细胞生成素及其受体在视网膜正常发育和ROP发病过程中的作用

材料与方法

结果

讨论

附图

第三部分 促红细胞生成素治疗模型小鼠视网膜病变的实验研究

材料与方法

结果

讨论

附图

结论

参考文献

综述 促红细胞生成素与视网膜保护作用

致谢

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摘要

第一部分 目的：建立符合早产儿视网膜病变(ROP)病理特点的动物模型，为研究该病的发病机制及治疗提供实验基础。 方法：选择7日龄(P7)C57BL/6J新生小鼠48只，分为正常空气组和模型组，每组24只。正常空气组小鼠在正常空气环境中生长至17日龄(P17)；模型组小鼠在氧浓度为75％的环境中生长至12日龄(P12)，然后回到正常空气环境中生长至17日龄(P17)。采用视网膜铺片ADP酶血管组织化学染色法观察小鼠视网膜血管化的情况(包括血管闭塞的情况和新生血管形成的情况)；将视网膜组织切片进行常规HE染色，通过计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目，定量反映小鼠视网膜新生血管的程度。所有数据采用SPSS11.0 for windows软件进行统计分析。 结果：正常空气组小鼠视网膜完全血管化，血管发育成熟，深浅两层血管网形态清晰。模型组小鼠12日龄(P12)时可见大血管管径变细，血管走行僵直，分支减少，出现大片无血管区；15日龄(P15)时大血管呈节段性的扩张与迂曲，出现新生血管；17日龄(P17)时新生血管大量形成，深浅两层血管网结构破坏。17日龄(P17)正常空气组小鼠突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目仅为(1.27±0.29)个，而模型组达到(38.9±3.72)个，具有显著性统计学差异(P<0.001)。 结论：该小鼠模型具有类似ROP的血管闭塞、血管无灌注区、新生血管形成等改变，制备过程较简便，重复性好、可定量研究，是研究。ROP比较合适的动物模型。第二部分 目的：从现代分子生物学的角度，分析新生小鼠视网膜正常发育及氧诱导视网膜病变过程中，促红细胞生成素(Erythropoietin，Epo)、促红细胞生成素受体(Erythropoietin Receptor，EpoR)和血管内皮生长因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)的基因调节规律及蛋白表达规律，阐明Epo和其受体在视网膜血管发育及ROP发生发展中的作用。 方法：选择7日龄(P7)C57BL/6J新生小鼠96只，分为正常空气组和模型组。用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定不同时间点两组小鼠视网膜上Epo、EpoR以及VEGF的mRNA水平，观察其变化规律；运用免疫组化法观察不同时间点两组小鼠视网膜切片细胞胞质中Epo、EpoR以及VEGF蛋白的表达情况，并检测切片染色的平均灰度值以测定其蛋白表达水平。具体取材时间是：自P7起至P21隔天每组各取6只小鼠，小鼠左眼视网膜行RT-PCR，右眼行免疫组化。所有数据采用SPSS 11.0 for windows软件进行统计分析。 结果：在正常空气组中，小鼠视网膜Epo mRNA自P7起表达水平逐渐上升，P9达到高峰，自P11起开始下降，并维持在较低水平表达至P21。小鼠视网膜EpoRmRNA自P7起逐渐下降，P15起维持在较低水平至P21。小鼠视网膜VEGFmRNA自P7起上升，P9达到高峰，P11起出现下降并始终维持在低水平表达。 在模型组中，小鼠视网膜Epo mRNA表达水平自P7起开始下降，整个吸氧阶段持续降低。至出氧箱后Epo表达量缓慢上升，自P15起显著上升，并始终维持在较高水平的表达直至P21。小鼠视网膜EpoR mRNA自P7起上升，P11达到高峰，并始终维持在较高水平表达直至P21。小鼠视网膜VEGF mRNA自P9起显著下降，且在整个吸氧阶段呈现持续降低的趋势，P11达到最低。至出氧箱后表现为缓慢上升的状态，于P15起显著上升，P17到达高峰，并持续维持在较高的水平上表达直至P21。Epo、EpoR和VEGF的蛋白表达水平变化趋势与其基因表达变化趋势基本相同，但略晚于其基因水平的变化。 结论：Epo、EpoR及VEGF在视网膜正常发育和ROP发生发展中均起作用。第三部分 目的：用Epo对C57BL/6J新生小鼠的氧诱导视网膜病变进行实验干预研究，从治疗角度阐述Epo在ROP发生发展中的作用。 方法：选择7日龄(P7)C57BL/6J新生小鼠96只，在75％的高氧环境中饲养5天至12日龄(P12)后再放至正常空气中饲养5天至17日龄(P17)，在不同的时间段腹部皮下注射不同剂量Epo或者生理盐水(NS)或是加热灭活的Epo作为对照，共分为16组。组1～组4每只小鼠Epo注射剂量为2500U/Kg。其中组1是正常空气组小鼠，给药时间段为P7-P17；组2～组4是模型组小鼠，给药时间段分别为P7-P12、P12-P17和P15-P17。组5～组8每只小鼠Epo注射剂量为5000U/Kg。其中组5是正常空气组小鼠，给药时间段同组1；组6～组8是模型组小鼠，给药时间段同组2～组4。组9～组12每只小鼠Epo注射剂量为10000U/Kg。其中组9是正常空气组小鼠，给药时间段同组1；组10～组12是模型组，给药时间段亦同组2～组4。组13是正常空气组，组14是模型组，每只小鼠在P7-P17腹部皮下注射NS，剂量为0.05ml。组15是正常空气组，组16是模型组，每只小鼠在P7-P17腹部皮下注射加热灭活的Epo，剂量为5000U/Kg。各组小鼠均于17日龄(P17)时取其左眼进行视网膜铺片ADP酶组织化学染色，取其右眼行视网膜组织切片常规HE染色。通过视网膜铺片和切片结果观察血管形态学改变、视网膜血管化情况和新生血管增生情况。所有数据采用SPSS11.0 forwindows软件进行统计分析。 结果：(1)所有正常空气组小鼠，无论注射何种剂量何种药物，P17时视网膜铺片结果均显示视网膜完全血管化，血管发育良好，两层血管网结构清晰。所有模型小鼠的视网膜铺片结果均显示P17时有无血管区，同时伴有不同程度的新生血管，局部出现血管闭塞或/和血管扩张，浅层和深层血管网形态发生改变。但很难从形态学上比较各组之间的差异。(2)正常空气组小鼠在注射Epo后，按照剂量从小到大，各组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目依次为：1.17±1.16，1.00±0.89，0.83±0.75，而NS组为1.33±0.52，加热灭活Epo组为1.17±0.75，五组间两两比较均无统计学差异(P>0.05)。但与所有模型组结果相比具有统计学差异(P<0.05)。在模型组小鼠中，注射Epo后各组视网膜切片中突破内界膜的新生血管内皮细胞核数目都有所减少，与NS组相比有显著差异(P<0.001)，与注射加热灭活Epo组相比差异亦非常显著(P<0.001)。(3)不同剂量Epo注射后结果显示各组在P7-P12时间段给药突破内界膜的血管内皮细胞核数目最少，与P12-P17和P15-P17时间段相比差异有显著意义(P<0.05)。 结论：在新生小鼠视网膜病变发病的早期(P7-P12)给予Epo治疗可明显改善病情，提示Epo在ROP的发生发展中起重要作用，这为ROP的防治开辟新的思路和途径。

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