幽门螺杆菌肽脱甲酰基酶基因的克隆、表达、纯化及活性研究

代理获取

页面导航

目录
摘要
著录项
相似文献
相关主题

摘要

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)，是胃炎、消化道溃疡的主要致病因素之一，与胃癌的发生密切相关，由于人群感染率高、危害大，世界卫生组织已将其列为第一类致癌因子。传统抗菌素治疗存在着治愈率低、复发率高和菌株耐药性等问题，开发新型的抗菌药物成为亟待解决的问题。寻找特异、准确的靶位是筛选新型抗菌药物的关键。与哺乳动物相比，细菌的蛋白合成具有其特点。细菌蛋白质合成后，其多肽链N-端为甲酰化的蛋氨酸，需要首先通过肽脱甲酰基酶(peptidedeformylase，PDF)去除甲基后才能成为成熟蛋白，否则不能完成上述过程，细菌无法生长。因此，PDF成为药物筛选的新型和潜在的靶位。本实验选择了幽门螺杆菌国际标准株1株、澳大利亚株1株和我国不同地区(华北、华东、西南、华南)的12个分离株，对其def基因进行了克隆及序列比较，并尝试了在不同载体中进行表达。根据GenBank已公布的幽门螺杆菌国际标准株26695、J99的肽脱甲酰基酶基因(deformylase，def)的核苷酸序列，在培养鉴定的基础上提取细菌DNA，设计特异引物，以PCR方法扩增了def,并克隆到pGEM-Teasy载体中。序列分析表明，所克隆的不同菌株的def基因均为525bp，核苷酸序列的一致性达到了97.50％，氨基酸序列的一致性高达98.13％，与功能相关的基序点未发生变异。这一结果表明，与其它细菌相同，Hp具有肽脱甲酰基酶基因(def)的高度保守性。本工作为表达PDF奠定了基础，同时，为以PDF为靶位筛选抑制剂提供了理论基础。选取和其它株同源性较高的DM株，将def基因克隆入pET-32a(+)表达载体，在宿主细胞BL21(DE3)中进行表达。结果显示，def基因可以融合蛋白的形式高效表达，但产物大部分以包涵体形式存在，可溶部分含量较低。通过金属螯和亲和层析法纯化可溶性融合蛋白，肠激酶酶切后，获得游离PDF；包涵体变性后，经金属螯和亲和层析法纯化，透析复性；经检测，可溶性融合蛋白、游离PDF和复性的包涵体蛋白均具有肽脱甲酰基酶活性。为高效表达可溶性PDF蛋白，以更好地保持酶的活性，将def基因克隆入pET-22b(+)表达载体于BL21(DE3)中诱导表达，发现表达量低，且多以包涵体的形式存在，结果不甚理想。将def基因克隆入pTrcHisB载体中，分别在宿主细胞TOP10、BL21(DE3)、DH5α、JM109中诱导表达，发现只有在BL21(DE3)宿主细胞中获高效表达，且产物以可溶状态存在。以金属螯和亲和层析法进行纯化后检测，显示其具有较高酶活性。以上工作筛选获得了pTrcHisB-def高效表达系统，为PDF特性分析及筛选PDF抑制剂奠定了基础。

著录项

作者
幺山山;
展开▼
作者单位

解放军军事医学科学院;

中国人民解放军军事医学科学院;

展开▼
授予单位解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院;
学科免疫学
授予学位硕士
导师姓名章金刚;
年度 2005
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类病原细菌;医学免疫学;
关键词
幽门螺杆菌; 肽脱甲酰基酶; 基因克隆; 胃炎; 消化道溃疡;

相似文献

中文文献
外文文献
专利

1. 幽门螺杆菌肽脱甲酰基酶基因的表达、纯化与活性检测 [J] . 幺山山 ,曾明 ,章金刚 . 药品评价 . 2005,第003期
2. 幽门螺杆菌肽脱甲酰基酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达与活性检测 [J] . 幺山山 ,曾明 ,章金刚 . 生物技术通讯 . 2005,第004期
3. 人肽脱甲酰基酶基因真核表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达 [J] . 何睿 ,黄恺飞 ,罗学刚 . 中国药科大学学报 . 2008,第6期
4. 人单酰基甘油脂肪酶基因的克隆表达、纯化及活性研究 [J] . 朱京童 ,张駪 ,郑海洲 . 中国抗生素杂志 . 2012,第008期
5. 类风湿关节炎患者滑膜抗环瓜氨酸肽表位表达与肽酰基精氨酸脱亚氨酶4基因的相关性分析 [J] . 沈小辉 ,喻伟 ,杨菲 . 现代检验医学杂志 . 2016,第003期
6. 幽门螺杆菌肽脱甲酰基酶基因的高效表达及包涵体复性研究 [C] . 幺山山 ,王薇 ,王斌 . 第八次全国生物制品学术会议 . 2005
7. 肽脱甲酰基酶的表达纯化及其抑制剂的研究 [A] . 王兰兰 . 2009

幽门螺杆菌肽脱甲酰基酶基因的克隆、表达、纯化及活性研究

目录

摘要

著录项

相似文献

相关主题

期刊订阅