一、抗结肠癌中草药活性成分的分离纯化及其作用机理的研究;二、线虫Haemonchus contortus脂肪酸结合蛋白的研究

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恶性肿瘤是威胁人类健康和导致死亡的主要原因之一，在过去的10年间，全球癌症发病率增长了22％，并呈逐年上升的趋势。由于目前对于大多数恶性肿瘤来说还没有根治的方法，因此恶性肿瘤仍将继续威胁人类的健康。结肠癌是消化道中最常见的恶性肿瘤之一，是仅次于肺癌的第四大杀手。目前临床上主要采用手术治疗、放疗和化疗来治疗晚期结肠癌病人，但是放疗或化疗毒副作用太大，驱邪伤正，不仅能杀伤肿瘤细胞，也能大量杀伤正常细胞，从而产生严重的副作用导致治疗失败，具有明显的局限性。这就迫使人们继续去寻找毒性低、副作用小的抗癌药物，而中国传统中草药中丰富的天然产物则是重要的筛选来源。目前应用的抗肿瘤活性药物多数是由来源于中药或植物药的先导化合物改造而来，这些天然产物为设计更理想的新药提供了结构独特的前体。它们通过不同的作用机理发挥治疗或预防肿瘤的作用，使天然产物的多样性发挥出抗癌作用的多样性。因此从中药或植物药中发现有效抗结肠癌的新药具有重要的科学意义和巨大的市场前景。
　　水线草为茜草科植物水线草Oldenlandia(Hedyotis)corymbosa L.的全草，又称伞房花耳草、蛇舌草，在我国分布广泛，具有清热解毒，利湿消肿、抗肿瘤以及提高机体免疫力等功效，临床常用于治疗咽喉肿痛、湿热黄疸、毒蛇咬伤以及胃癌、食管癌、肠癌、鼻咽癌等恶性肿瘤。近年来，水线草在抗肿瘤方面的作用引起了药学工作者的关注，也得到了国内外学者部分研究结果的支持。据报道，水线草在传统水线胃安复方中是作为君药用于慢性胃炎、肠道肿瘤等方面的临床治疗，效果显著。另外，水线草也具有抑制植入皮下肿瘤的作用，且能显著促进白细胞放射性损伤后的恢复。本实验的前期工作则发现水线草粗提物可以抑制结肠癌细胞体外的增殖、抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的生成，显示出明显的抗肿瘤活性。这些研究结果均表明水线草具有抑制肿瘤的作用。目前对水线草中抗肿瘤活性的化学成分知之甚少，对其抗肿瘤作用的研究大部分仍然停留在复合成分阶段，因而，在水线草中获得结构新颖的具有抗结肠癌活性的化合物就成为可能。本实验中，我们在生物活性的指导下对水线草的化学成分进行了分离、纯化及鉴定，并找出了其中具有抗结肠癌活性的单体化合物，为进一步的研究奠定了基础。
　　柘木为桑科构棘属植物，广泛分布于我国各地。柘木的干燥根及木材在传统医学中主要有清热凉血，舒筋活络的作用。除了传统的应用领域外，近代民间开始将柘木用于消化道肿瘤治疗。世纪70年代柘木被制成糖浆和注射剂用于临床治疗晚期消化道肿瘤，结果显示其能显著减轻化疗药物对免疫功能的抑制和损害从而降低化疗的毒副作用。另外，柘木也是已申请专利的抗癌中成药“生命之星”中的主要药材之一。临床试验证明，柘木对各种癌症均有较好的疗效并且毒副作用较小。柘木全株中含有黄酮类、生物碱及杂蛋白、鞣质、多糖等多种成分。随着柘木在肿瘤治疗上应用的扩大，近年来国内外学者开始投身于柘木化学成分与其药理研究中，并取得了一定进展。Isoalvaxanthone(IAX)和Cudratricusxanthone G(CIXG)是从柘木中分离得到的两个结构新颖的(口山)酮类化合物。前期工作表明，IAX和CTXG显示出明显的抑制消化道癌细胞生长的作用。本实验在前期工作的基础上对柘木的活性成分IAX和CTXG进行了抗结肠癌活性的鉴定并对它们的作用机理进行了研究。
　　本论文主要分成以下几个部分：
　　一、水线草化学成分的分离、纯化与结构鉴定
　　首先，我们采用正、反相柱层析的方法在抗结肠癌活性的指导下对水线草中的化学成分进行了分析、分离及纯化，得到活性单体化合物。其次，利用核磁共振及各种波谱方法对分离所得的单体化合物进行了化学结构的鉴定，共得到了23个化合物，包括3个新的环烯醚萜苷类化合物和20个已知化合物，为进一步研究奠定了基础。
　　二、水线草抗结肠癌活性成分的鉴定及作用机理
　　首先，通过多种活性鉴定的方法分别检测了不同分离阶段的水线草提取物对结肠癌细胞的存活率、细胞形态、细胞周期分布等多方面的影响，评估了各样品的体外抗结肠癌活性，为活性成分的分离提供了方向。其次，对最后分离得到的23个单体化合物进行了活性鉴定，发现其中有4个化合物具有显著的抗结肠癌活性。它们是槲皮素、香豆素化合物Hedyotiscone A、β-谷甾醇和丁香酸。其中，香豆素化合物Hedyotiscone A虽为已知化合物，但尚未有过关于其生物活性的报道。我们分别对这四种化合物的抗结肠癌机理进行了初步研究，结果发现它们均能诱导结肠癌细胞凋亡。其中，经Hedyotiscone A处理过的结肠癌细胞HCT-8及RKO的细胞周期被阻断，并出现细胞核染色质皱缩等明显的凋亡特征，说明Hedyotiscone A可能通过诱导细胞凋亡的作用来发挥抗结肠癌活性。同时，半定量PCR实验揭示Hedyotiscone A可以抑制HCT-8细胞中bax基因的表达，这说明HedyotisconeA可能通过与bax有关的信号通路来发挥诱导凋亡的作用。
　　三、柘木活性成分Isoalvaxanthone的抗结肠癌活性及其机理
　　 Isoalvaxanthone(IAX)是从柘木中分离得到的一种小分子(口山)酮类化合物，通过检测IAX对细胞存活率的影响及其细胞毒性，我们首先鉴定了IAX在0.1～10μM的浓度下具有抑制结肠癌细胞SW620增殖的作用并在浓度约为1μM时达到半数抑制效果，而在此浓度范围内IAX的细胞毒性则非常小，10μMIAX作用后的细胞存活率仍为88.9％。流式细胞术检测发现IAX可以将SW620细胞阻断在S/G2期。肿瘤相关基因表达谱的检测表明IAX能够影响与肿瘤转移密切相关的基因如CyclinD1,AKT1等的表达上调和RhoB等的表达下调。细胞划痕实验、Borden chamber实验证实了IAX在0.1～10μM的浓度下可以显著抑制结肠癌细胞的迁移和浸润。随后，我们又用GST-Pull Down实验、EMSA实验等证明了IAX可以通过阻止ERK/Racl/JNK/AP-1的信号传递抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和浸润等肿瘤转移的关键步骤，从而发挥其抗结肠癌的活性。
　　四、柘木活性成分CTXG的抗结肠癌活性及其机理
　　 CTXG是另一种从柘木中分离得到的一种小分子(口山)酮类化合物，其结构与IAX十分相似。与研究IAX的过程相似，我们鉴定了CTXG在0.1～10μM的浓度下能够显著抑制结肠癌细胞的生长、迁移和浸润，并在1μM左右达到半数抑制效率。同时，我们也对CTXG抗结肠癌的分子机理进行了研究，结果表明CTXG在01～10μM的浓度范围内可以通过阻止ERK/Racl/JNK/AP-1的信号传递抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和浸润等肿瘤转移的关键步骤，从而发挥其抗结肠癌的活性。
　　本部分实验得到的结论：
　　 1.在生物活性的指导下分离得到了23个水线草单体化合物，其中有3个结构新颖，为首次分离得到。
　　 2.分离纯化得到的水线草化合物中有4个具有显著的抗结肠癌活性，分别是槲皮素、香豆素化合物HedyotisconeA、β-谷甾醇和丁香酸。
　　 3.证明了槲皮素、香豆素Hedyotiscone A、β-谷甾醇和丁香酸可以通过诱导结肠癌细胞凋亡而发挥抗结肠癌作用，且Hedyotiscone A的诱导凋亡作用与Bax基因的上调有关。
　　 4.检测了柘木成分IAX的抗结肠癌活性并证明了IAX可以通过ERK/Racl/JNK/AP-1相关的信号通路抑制肿瘤转移的关键步骤从而发挥抗结肠癌的作用。
　　 5.检测了柘木成分CTXG的抗结肠癌活性并证明了IAX可以通过ERK/Racl/JNK/AP-1相关的信号通路抑制肿瘤转移的关键步骤而发挥抗结肠癌的作用。
　　许多线虫能够分泌两种独特的脂肪酸结合蛋白NPA和FAR。但迄今为止，没有任何证据表明啮齿类动物寄生虫H.contortus也表达这两种蛋白质。在本研究中，我们运用蛋白组学和生物信息学相结合的手段证实了H.contortus成虫的分泌物中含有这两种脂肪酸结合蛋白。我们的分析首先确定了H.contortus ESP中含有与O.ostertagi NPA和FAR蛋白的同源物。随后用O.ostertagi NPA和FAR以及C.elegans FAR蛋白对H.contortus EST和基因组DNA数据库的搜索发现其中有许多DNA是NPA和FAR的编码序列。对这些序列的分析也揭示了H.contortusNPA和FAR蛋白的多样性，同时提示应对ESP产物进行进一步的基因组学分析。我们将H.contortus DNA数据库中编码NPA和FAR的序列全部翻译成蛋白质序列后构建了一个包含有大量来源于H.contortus的蛋白质信息的数据库，并用此数据库对MS/MS的数据重新进行分析。这一轮的分析为H.contortus NPA和FAR蛋白提供了更多的肽序列证据，特别是对应与NPA的肽序列增加了有数十倍之多。最后的结果是本研究中鉴定的肽序列在H.contortus NPA上的氨基酸覆盖率为49-60％，而在H.contortus FAR蛋白上的覆盖率为7-47％。另外，本研究中也对编码H.contortus NPA和FAR的基因序列的结构进行了分析。我们推测H。contortus中至少含有两个hc-npa和六个hc-far基因，同时也发现hc-far-1,-2,-3-4基因在H.contortus生活史的不同阶段有差异表达。

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作者
旷丽莎;
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作者单位

华东师范大学;

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授予单位华东师范大学;
学科生物医学
授予学位博士
导师姓名钱旻;
年度 2009
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正文语种中文
中图分类中草药疗法;
关键词
脂肪酸结合蛋白; 结肠癌; 中草药疗法; 活性成分; 抗癌药物; 水线草;

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