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海带配子体lhcf5基因的克隆及在雌、雄配子体中的差异表达分析

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引言

1 海带与海带配子体

1.1 海带的价值

1.2 海带的生活史和应用

1.3 海带雌、雄配子体的差异

2 藻类的光捕获蛋白

2.1 杂色藻类褐藻素-叶绿素a/c结合蛋白基因

2.2 杂色藻类褐藻素-叶绿素a/c结合蛋白基因表达特征

3 基因组步移技术概述

3.1 各种启动子扩增方法的介绍

3.2 基因组步移的应用

4 本研究的目的与技术路线

第一章 海带配子体叶绿素a/c结合蛋白基因lhcf5的克隆及其序列分析

1 材料与方去

1.1 菌株和载体

1.2 主要试剂

1.3 材料培养

1.4 核酸提取及验证

1.5 引物设计

1.6 海带雌、雄配子体lhcf5基因的cDNA全长克隆

1.7 序列分析

1.8 海带雌、雄配子体lhcf5基因的DNA全长克隆

2 结果与讨论

2.1 海带配子体总RNA质量

2.2 lhcf5基因在cDNA中的扩增结果

2.3 lhcf5基因cDNA全长序列拼接及生物学分析

2.4 海带配子体DNA质量

2.5 lhcf5基因的内含子

第二章lhcf5 基因在海带雌、雄配子体之间的差异表达

1 材料与方去

1.1 海带配子体培养

1.2 RNA抽提

1.3 实时荧光定量PCR(Q-RT-PCR)

2 结果

2.1 光照强度对海带配子体lhcf5基因表达的影响

2.2 光质对海带配子体lhcf5基因表达的影响

2.3 海带配子体lhcf5基因的日表达

2.4 在有利于配子发生条件下,lhcf5基因在海带雌、雄配子体中的差异表达

3 讨论

3.1 海带配子体lhcf5基因表达与光的关系

3.2 海带配子体lhcf5基因的节律性调控

3.3 海带配子体lhcf5基因的表达与配子体生长发育的关系

第三章 海带雌、雄配子体lhcf5基因5'-端上游序列的克隆及分析

1 材料与方去

1.1 菌株和载体

1.2 主要试剂

1.3 实验材料及培养

1.4 基因组DNA提取

1.5 利用TaKaRa试剂盒的步移

1.6 利用Clontech试剂盒的步移

1.7 目的片段克隆

1.8 阳性克隆鉴定

2 结果与讨论

2.1 第一次基因组步移

2.2 第二次基因组步移

2.3 第三次基因组步移

2.4 第四次基因组步移

2.5 第五次基因组步移

2.6 序列分析

小结

参考文献

附录

致谢

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摘要

海带(Laminariajaponica Aresch.)隶属褐藻门(Phaeophyta)、海带目(Laminariales),具有明显的大型孢子体和微型配子体的异型世代交替生活史。海带是我国海水养殖业中一种重要的经济藻类,对近海海洋环境与海水养殖业的可持续发展起着至关重要的作用。至今,人们对海带雌、雄配子体生长发育的分子机制研究很不透彻。
   根据海带(Laminariajaponica)雄配子体抑制消减cDNA文库中E04克隆序列及糖海带(L.saccharina)lhcf5基因的cDNA序列(GenBank登录号:AF226861)设计引物并进行反转录PCR扩增,获得海带雄配子体lhcf5基因的全长cDNA序列(GenBank登录号:EU751620)。它长1078bp,其中5'-非翻译区(UTR)长22bp,开放阅读框(ORF)长657bp,3'-UTR长399bp并具有典型的poly(A)尾巴。雌、雄配子体lhcf5基因的cDNA序列完全一致。海带配子体lhcf5基因的ORF编码218个氨基酸,与糖海带lhcf5所编码氨基酸序列的相似性高达98%;编码蛋白氨基端的前40个氨基酸组成了跨质体内质网和叶绿体膜信号肽;跨膜酶切后变为含178个氨基酸的成熟蛋白,它的分子量为19.3kD,等电点为4.86。预测的成熟蛋白LHCF5高级结构存在4个保守性的β-折叠和3个跨类囊体膜的α-螺旋区。利用基因组DNA为模板,把PCR产物的序列与该基因cDNA序列比对,结果发现海带雌、雄配子体lhcf5基因都存在着一个1134bp的内含子,位于起始密码子后的第62bp处,剪切位点完全符合“GT-AG”规则。
   利用实时荧光定量PCR(Q-RT-PCR)技术,以海带18SrRNA作为内参基因,进一步研究和比较lhcf5基因在不同光强、光质、利于配子发生条件以及节律性表达规律。结果显示,lhcf5基因在黑暗中接近不转录;雌配子体在40unolm-2·s-1时转录量最高,而雄配子体的最高转录量出现在80umiolm-2·s-1的光照强度处;高于最适宜的光照强度,lhcf5基因的转录量随光照强度增加而降低。相对于同等强度的白光来说,短时间(3d)和长时间(7d)的红光照射,都能促进lhcf5基因的相对转录水平;蓝光对雌配子体lhcf5基因转录的促进作用不明显,而它对雄配子体lhcf5基因的转录有一定的促进作用。营养生长阶段的海带配子体,不管处于正常光照条件还是持续黑暗条件下,lhcf5基因存在一定的节律性,其生物钟发生一定的程度的振荡,正常光周期下lhcf5基因在雌配子体12:00和24:00表达量最高,而雄配子体表达量最高点为12:00;处于持续黑暗条件下时该基因在雌配子体18:00时表达量最高,而雄配子体表达量最高点时为24:00。将海带配子体从营养生长转至有利于配子发生的条件下,雌、雄配子体lhcf5基因在第1天的转录量都明显增加;雌配子体在第4天及第14天显著增加,第6及第10天接近不转录;雄配子体在第8天及第14天增加,第10天也近似不转录;发育阶段其它时间内的转录量均低于营养生长期的。其转录可能因有利于配子体细胞叶绿体结构的完善及物质与能量的积累,而利于细胞分裂与营养生长;lhcf5基因在雌、雄配子体中的表达存在节律性特点,可能受生物钟调控。
   用基因组步移(genomewalking)的方法在lhcf5基因序列的基础上克隆其5'-端上游序列。对5次基因组步移反应的结果进行拼接,获得4047bp长的序列。通过软件,发现TATA-box在转录起始位点的-28bp处,并预测了调控区中存在如节律性、光、环境等调控元件,推测它们有可能通过不同的信号传导途径引起该基因在雌、雄配子体之间的差异表达。关于lhcf5基因的转录调控等问题有待进一步探讨。

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