斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)肝脏表达的抗菌肽-2(LEAP-2)的cDNA克隆及其在E.coli中的融合表达

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引 言

1我国水产养殖存在的问题

2新型饲料添加剂抗菌肽

3抗菌肽简介

3.1抗菌肽的定义及分类

3.2水生生物抗菌肽的研究进展

4抗菌肽的抑菌机理

5本研究的目的和意义

第一章肝脏表达的抗菌肽-2基因的cDNA克隆

1.1材料

1.1.1实验鱼

1.1.2质粒

1.1.3主要试剂及试剂盒

1.1.4主要仪器

1.1.5主要试剂的配制

1.2方法

1.2.1斑点叉尾鲴肝脏总RNA的提取

1.2.2 cDNA第一链的合成

1.2.3 LEAP-2基因的克隆

1.2.4.连接反应

1.2.5超级感受态细胞的制备

1.2.6重组质粒的转化

1.2.7阳性克隆的PCR检验

1.2.8重组质粒的扩大培养

1.2.9基因的序列测定及分析

1.3结果与讨论

1.3.1总RNA的抽提结果

1.3.2 RT-PCR法对斑点叉尾鮰LEAP-2基因的cDNA扩增结果

1.3.3插入检验鉴定阳性克隆及测序结果

1.3.4 LEAP-2的cDNA序列分析

1.3.5氨基酸序列比较

1.4本章小结

第二章LEAP-2的表达载体的构建及融合表达

2.1材料

2.1.1质粒

2.1.2菌株

2.1.3主要试剂及试剂盒

2.1.4主要仪器

2.1.5主要试剂的配制

2.2方法

2.2.1 LEAP-2基因的获得

2.2.2 IpL-2片段的双酶切回收

2.2.3重组表达质粒的构建

2.2.4基因工程菌的诱导表达

2.2.5融合蛋白表达形式鉴定

2.2.6融合蛋白的Tricine-SDS-PAGE电泳分析

2.3结果与讨论

2.3.1IpL-2片段的PCR产物

2.3.2重组克隆质粒的双酶切鉴定

2.3.3阳性克隆鉴定

2.3.4重组质粒的双酶切鉴定

2.3.5重组质粒在大肠杆菌中的表达

2.4本章小结

第三章融合蛋白的纯化及检验

3.1材料

3.1.1菌种

3.1.2质粒

3.1.3主要仪器

3.1.4主要试剂及材料

3.1.5主要溶液

3.2方法

3.2.1宿主菌的培养

3.2.2包含体的破碎和溶解

3.2.3融合蛋白的纯化

3.2.4融合蛋白的Tricine-SDS-PAGE分析

3.2.5融合蛋白的Western blot分析

3.3结果与讨论

3.3.1融合蛋白的Tricine-SDS-PAGE分析

3.3.2融合蛋白的Western blot分析

3.4本章小结

第四章结论与展望

参考文献

附录

致谢