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Capsazepine抑制中枢甘氨酸受体及其机制研究

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摘要

第一章 绪论

1.1 甘氨酸受体

1.1.1 甘氨酸受体的结构

1.1.2 甘氨酸受体的电生理特性

1.1.3 甘氨酸受体的调控

1.1.4 甘氨酸受体的功能

1.2 Capsazepine

1.2.1 CPZ竞争性抑制辣椒素激活的TRPV1效应

1.2.2 CPZ不依赖于TRPV1的效应

1.3 本课题的研究目的和内容

第二章 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 HEK293细胞的培养和转染

2.2.2 原代海马神经元与脊髓神经元的培养

2.2.3 小鼠TRPV1基因鉴定

2.2.4 单细胞膜片钳电生理记录

2.2.5 细胞免疫化学染色及激光共聚焦显微镜技术

2.2.6 生物素标记分离膜蛋白实验

2.2.7 蛋白质免疫印迹(Western Blot)

2.2.8 统计学方法

第三章 实验结果

3.1 CPZ抑制海马和脊髓神经元中甘氨酸诱发的电流

3.2 CPZ抑制海马神经元甘氨酸诱发的电流不依赖于TRPV1

3.3 CPZ抑制甘氨酸受体与其亚基组成的关系

3.4 不同给药方式下CPZ对甘氨酸诱发电流的影响

3.5 CPZ非竞争性抑制甘氨酸诱导的电流

3.6 CPZ抑制甘氨酸诱发的电流不具有电压依赖性

3.7 CPZ对膜表面甘氨酸受体的数量的影响

3.8 钙对CPZ抑制甘氨酸诱发电流的影响

3.9 CPZ抑制甘氨酸受体不依赖PKC

3.10 膜贴附式记录CPZ对甘氨酸受体单通道活动的效应

3.11 膜外面向外记录CPZ对甘氨酸受体单通道活动的效应

第四章 结论与讨论

4.1 CPZ对甘氨酸受体抑制的药理学特性

4.2 CPZ抑制甘氨酸受体的机制探讨

4.3 甘氨酸受体与疾病的关系及临床药物治疗的展望

附录缩略词表

参考文献

致谢

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摘要

兴奋性和抑制性的稳态调节维持中枢神经系统(CNS)的正常功能。甘氨酸受体(GlyRs)与抑制性递质甘氨酸结合后开放氯离子通道介导抑制性突触传递,在成年哺乳动物CNS中起抑制性效应。甘氨酸受体通过先天突变或RNA编辑或磷酸化修饰,产生功能紊乱和障碍,机体发生病理变化。以甘氨酸受体为靶点的药物研究使我们能够深入认识其在体内的生理功能,为寻找开发新的药物并应用于临床治疗提供线索与依据。
  Capsazepine(CPZ)是TRPV1的拮抗剂。我们发现,在培养的海马和脊髓神经元中,CPZ可以抑制甘氨酸诱发的电流。姜黄素,TRPV1的另一种拮抗剂则对甘氨酸受体没有抑制效应;而在TRPV1敲除小鼠,CPZ对甘氨酸受体具有与野生型动物同样的抑制效应。以上证据说明CPZ特异性地抑制GlyRs,并且不依赖于TRPV1的作用。CPZ有效地抑制了饱和浓度的甘氨酸反应,没有改变甘氨酸激活GlyRs的EC50和Hill常数,表现为非竞争性地抑制。在HEK293细胞系异源表达甘氨酸受体的不同亚基组成的异构体,CPZ对各种甘氨酸受体的异构体均有抑制效应。
  免疫细胞化学实验结果显示CPZ处理后神经元膜表面GlyRs斑点数量和荧光强度没有明显变化;生物素方法检测膜蛋白和总蛋白中GlyRs的含量,免疫印迹结果显示CPZ作用后神经元膜表面的GlyR表达量没有明显变化。因此,CPZ不是通过调控甘氨酸受体膜转运机制减少甘氨酸激发的电流。
  在单通道水平观察甘氨酸受体的门控,膜贴附式(cell-attached)记录表明CPZ降低了甘氨酸受体的开放概率,对氯离子电导没有明显影响。在膜外面向外(outside-out)记录模式下,CPZ对甘氨酸受体单通道活动没有明显影响,提示CPZ不与甘氨酸受体直接结合,可能是通过细胞内机制对甘氨酸受体发挥抑制效应。
  总之,以上的研究结果表明CPZ可能通过细胞内机制抑制甘氨酸受体介导的电流,并且此效应不依赖TRPV1的作用。本课题为认识CPZ在CNS中的作用提供新的见解,为其作为TRPV1拮抗剂在实验科学中的应用提供了更为合理的依据。

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