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动脉粥样硬化易损斑块破裂炎症靶点探索与抗炎干预研究

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绪论

参考文献

第一部分他汀通过调控趋化因子和趋化因子受体发挥抗炎与稳定斑块的作用

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分核受体Nur77在动脉粥样硬化发生发展中的作用与机制研究

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分RXRα拮抗剂K-80003抗炎与稳定斑块作用研究

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文结论

附录

致谢

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摘要

动脉粥样硬化（AS）性疾病是全球范围内发病和死亡人数最多的疾病，大约75％心肌梗死患者是由病变冠脉的不稳定斑块破裂继发血栓形成引起。二十世纪，脂质浸润学说为AS发病机制的主流学说。以他汀类药物为代表的降脂药显著降低了AS患者主要不良心血管事件（MACE），但对他汀为基石的治疗方案的二级预防效果进行荟萃分析发现5年内MACE的发生风险仍高达21%。目前认为，动脉粥样硬化是一种由脂质和炎症共同驱动的慢性进展性疾病，他汀的剩余风险与目前AS抗炎治疗不足有关。因此，探索有前途的AS炎症靶点，尤其是发现与斑块破裂密切相关的靶点并对其进行有效的干预治疗有望进一步减少动脉粥样硬化病人的不良心血管事件的发生。
　　应用能模拟人体动脉粥样硬化易损斑块破裂的动物模型对有潜在治疗价值的靶点进行在体验证，是判定候选靶点价值性的有效手段。本课题组自主创立了“联合部分结扎左肾动脉，左颈总动脉诱导ApoE-KO小鼠颈动脉斑块破裂”模型（以下简称R+C模型），是到目前为止易损斑块破裂发生率最高(80%)的动物模型。
　　本课题拟利用R+C模型对在动脉粥样硬化易损斑块破裂中发挥重要作用的炎症靶点进行在体探索，并进一步行抗炎干预研究。首先,研究R+C模型对他汀治疗的反应性，以评估其作为抗动脉粥样硬化药物研发干预平台的价值。其次，研究核受体Nur77，RXRα在巨噬细胞的亚细胞定位与炎症激活的关系，并利用Nur77基因敲除小鼠观察其对动脉粥样硬化发生发展尤其是斑块稳定性的影响。最后应用RXRα拮抗剂K-80003观察这一新的抗炎药物的治疗价值并对其安全性进行评估。总之，本课题探索在易损斑块破裂中发挥重要作用的分子机制与炎症靶点，并进行初步干预研究，为从抗炎角度开发抗动脉粥样硬化药物提供新思路和新依据。
　　第一部分、他汀通过调控趋化因子和趋化因子受体发挥抗炎与稳定斑块的作用
　　目的：理想的动物疾病模型须对在人类治疗有效的药物具备一致的反应性。他汀类药物通过抗炎和稳定斑块发挥心血管保护作用，我们观察阿托伐他汀（10mg/kg/day）在不影响血脂水平的情况下对R+C模型易损斑块的影响。并深入研究他汀稳定斑块作用的抗炎机制。
　　方法：8-10周龄雌性ApoE-/-小鼠共30只，应用R+C的造模方法诱导颈动脉易损斑块形成，所有小鼠随机分为两组：对照组（给予生理盐水）和阿托伐他汀组（10mg/Kg.d），每日灌胃给药，持续8周后取材，制作左颈总动脉病理切片分析阿托伐他汀对斑块面积、斑块形态，斑块成份、胶原酶活性以及趋化因子表达水平的影响；流式细胞法分析他汀对小鼠外周血单核细胞趋化因子受体表达；分离血浆检测两组血脂水平及炎症因子水平。
　　结果：(1)与对照组相比，阿托伐他汀组易损斑块检出率明显减少，但对斑块负荷无影响；(2)阿托伐他汀明显减少巨噬细胞浸润以及脂质在内膜下沉积，并增加斑块中胶原蛋白含量、降低胶原蛋白酶活性和基质金属蛋白酶（MMPs）表达；(3)阿托伐他汀下调斑块中趋化因子MCP-1，CX3CL1表达以及外周血单核细胞表面趋化因子受体CCR2、CX3CR1的表达；(4)血浆炎症标志物hs-CRP和TNF-α在阿托伐他汀组小鼠明显降低，两组小鼠总胆固醇、甘油三酯水平无差异。
　　结论：(1) R+C模型在阿托伐他汀干预下，斑块趋于稳定并且炎症水平下调；R+C模型是一个较为理想的研究动脉粥样硬化易损斑块破裂机制与治疗手段的模式动物平台。(2)他汀可通过调控趋化因子及其受体表达减轻巨噬细胞在粥样硬化斑块内浸润从而发挥心血管保护作用。
　　第二部分、核受体Nur77在动脉粥样硬化发生发展中的作用及机制研究
　　目的：核受体Nur77是一种在动脉粥样硬化中起重要调控作用的转录因子。近几年发现Nur77在某些病理生理状态下发生核浆穿梭，在细胞浆发挥重要的“非转录依赖型功能”。本部分探讨在不同炎症状态的AS病变中Nur77在巨噬细胞中的定位，明确Nur77核浆定位与炎症的关系；并利用Nur77基因敲除小鼠观察其对动脉粥样硬化发生发展尤其是斑块稳定性的影响。
　　方法：分别在不同炎症程度的动脉粥样硬化斑块中行Nur77和巨噬细胞免疫荧光共染，明确Nur77核浆定位与炎症程度的关系。选取同窝Nur77+/+ApoE-/-（ApoE组）与Nur77-/-ApoE-/-（DKO组）小鼠，行R+C造模，分别于1W、2W、6W、8W颈动脉取材，制作病理切片。分析两组在不同病变阶段斑块面积，斑块表型，斑块成份的差异。
　　结果：(1)在人和小鼠动脉粥样硬化病变中都证明：在早期阶段，炎症程度较轻，Nur77定位于核内，而在炎症活跃的易损斑块，Nur77大量出核。这提示Nur77出核与炎症加剧密切相关。(2)应用基因敲除小鼠对Nur77的作用进行在体研究，发现在斑块早期阶段（1w+2w取材组），两组间斑块面积、斑块形态分析都没有差异。而在斑块急速进展成易损斑块并伴有高比例斑块破裂的6w+8w组，Nur77敲除后不稳定斑块，斑块出血，斑块破裂，斑块破裂伴腔内血栓的比例显著下降，斑块趋于稳定，斑块负荷显著减小。(3)对两组晚期病变进行斑块成份分析，发现Nur77敲除后平滑肌细胞显著增加，胶原酶表达显著减少，胶原含量增加。此外，巨噬细胞和斑块脂质含量都有下降的趋势。
　　结论：(1)动脉粥样硬化斑块巨噬细胞中Nur77的胞浆定位与炎症程度加剧密切相关；(2) Nur77胞浆定位促使斑块易损性显著增加以及斑块破裂的发生，是一个很好的稳定斑块的抗炎干预靶点。
　　第三部分RXRα拮抗剂K-80003的抗炎与稳定斑块作用研究
　　目的：RXRα在动脉粥样硬化发生进展中发挥重要的调控作用，经特殊修饰的舒林酸衍生物K-80003无COX抑制效应而具有对RXRα的高度亲和力。本部分探讨RXRα拮抗剂 K-80003对动脉粥样硬化尤其是斑块稳定性的影响，并评价其抗炎效应及安全性，明确其临床应用价值。
　　方法：8-10周龄雌性ApoE-/-小鼠R+C方法造模诱导颈动脉易损斑块形成，所有小鼠随机分为两组：对照组和K-80003组（15mg/Kg.d）。每日灌胃给药，4w，8w后取材，分析K-80003对斑块面积、斑块形态，斑块成份、胶原酶活性的影响；分析K-80003对斑块局部以及全身炎症状态的影响；最后对其安全性进行评价。
　　结果：(1)易损斑块巨噬细胞中RXRα的胞浆定位与炎症加剧密切相关；K-80003干预后斑块负荷显著减轻，斑块趋于稳定；(2)对斑块成份分析发现：K-80003显著减低巨噬细胞和脂质沉积，并且增加平滑肌细胞含量，降低胶原酶活性与MMPs的表达，使胶原含量增加；(3) K-80003抑制斑块NF-κB激活与TNF-α，IL-6，MCP-1的表达，降低血浆hs-CRP，TNF-α的水平。(4) K80003给药后对小鼠血脂，肝功，肾功均无影响，COX途径未受影响。
　　结论：(1) RXRα是一个潜在的易损斑块破裂抗炎治疗靶点；(2) RXRα拮抗剂K-80003通过调控斑块局部与系统性炎症水平，从而发挥抗AS以及稳定斑块的作用；(3) K-80003无COX抑制效应，对小鼠脂质代谢，肝肾功能亦无影响，安全有效，具有光明的临床应用前景。
　　总结：
　　本课题利用动脉粥样硬化人体标本以及自主构建的“动脉粥样硬化易损斑块破裂”动物模型，对Nur77亚细胞定位与动脉粥样硬化发生发展的关系进行在体研究，并对RXRα拮抗剂K-80003的临床应用价值进行评价，此外探讨他汀类药物抗炎作用机制。结果发现：(1) R+C模型在阿托伐他汀干预下，斑块趋于稳定并且炎症水平下调；R+C模型是一个较为理想的研究动脉粥样硬化易损斑块破裂机制与治疗手段的模式动物平台。阿托伐他汀可通过调控趋化因子及其受体表达减轻巨噬细胞在粥样硬化斑块内浸润而发挥抗炎与改善斑块稳定性的作用；(2)易损斑块巨噬细胞中Nur77、RXRα的胞浆定位与炎症加剧密切相关，Nur77敲除后斑块负荷显著减小，斑块趋于稳定；(3) RXRα拮抗剂K-80003可安全有效的调控斑块局部与系统性炎症水平，从而发挥抗AS以及稳定斑块的作用。本课题探索易损斑块新的炎症靶点并行干预研究，为易损斑块破裂的病理机制增添新的内容，为今后药物研发提供新的靶点与理论依据。

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