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【6h】

Snail基因调控视网膜色素上皮细胞间质化的研究

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摘要

增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是难治性致盲眼病。其纤维疤痕化病理过程呈“瀑布式”发展,其中视网膜色素上皮(retinal pigmentalepithelium,RPE)细胞发生上皮-间充质细胞转换(epithelial mesenchymal transition,EMT)是PVR启动和发展的关键,但调控EMT的机制尚不清楚。Snail基因是调控一些肿瘤及纤维化疾病过程中EMT的关键因素。PVR以细胞失控性大量增殖为特征,类似肿瘤和纤维化病理过程,然而,Snail基因是否在视网膜色素上皮-间充质细胞转换过程中同样发挥重要作用尚未明确。
　　目的
　　本研究的目的是调查PVR病理过程中Snail基因对视网膜色素上皮-间充质细胞转换的调控作用,进一步完善PVR的发病机制,为临床预防和治疗PVR奠定基础。
　　方法
　　1.调查正常人视网膜色素上皮细胞中内源性Snail基因的表达。体外培养人RPE细胞株ARPD19细胞,应用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcriptase-polymerasechain reaction,RT-PCR)和免疫印迹(western blot,WB)技术检测上皮细胞标志物E-钙粘素的表达,并关联ARPE-19细胞的形态特征,细胞形态采用相差显微镜进行观察记录。通过RT-PCR、WB和免疫荧光技术获得.ARPE-19细胞中内源性Snail基因在mRNA水平和蛋白水平的表达结果和规律。
　　2.视网膜色素上皮-间充质细胞转换体外模型建立。10ng/ml TGF-β1分别处理ARPE-19细胞6h,12h,24h,48h和72h,应用相差显微镜观察并记录细胞形态的变化。通过Real time-PCR和WB技术调查TGF-β1诱导后ARPE-19细胞中Snail基因及上皮细胞标志物E-钙粘素和闭锁小带1,间充质细胞标志物纤维粘连蛋白和α-肌动蛋白在mRNA水平和蛋白水平的表达变化。免疫荧光技术调查Snail、上皮和间充质细胞标志物的分布情况及变化。最终从细胞形态学方面和分子学水平得到RPE-间充质细胞转换的证据。
　　3.RNAi沉默Snail基因,反向验证Snail基因调控RPE细胞向间充质细胞转换。采用携带Snail基因短发夹结构转录单位的质粒pSuper-Smil-ShRNA转染ARPE-19细胞,通过嘌呤霉素筛选获得稳定表达Snail-ShRNA的ARPE-19细胞(空载质粒pSuper-control转染作为阴性对照),再应用10ng/ml TGF-β1处理稳定转染的ARPE-19细胞48h,通过免疫荧光技术检测Snail基因沉默效果,Real time-PCR和WB技术检测Snail基因沉默后上皮、间充质细胞标志物的表达变化,相差显微镜观察ARPE-19细胞形态变化。采用Transwell小室评估Snail沉默对ARPE-19细胞生物行为的影响。
　　4.PVR增生膜临床样本研究。收集10例孔源性视网膜脱离伴有D级PVR患者的视网膜前膜临床样本,通过免疫荧光技术调查Snail基因在PVR患者视网膜前膜临床样本中的分布情况,应用WB技术验证Snail基因在PVR患者的视网膜前膜样本中的表达。
　　结果
　　1.ARPE-19细胞形态呈典型的鹅卵石样上皮细胞形态,单层生长,排列规则;RT-PCR和wB技术从分子水平证实ARPE-19细胞表达上皮细胞标志物E-钙粘,此外,RT-PCR和WB结果显示ARPE-19细胞在mRNA和蛋白水平均表达少量内源性Snail基因;免疫荧光证实Snail蛋白分布于ARPE-19细胞胞浆,胞核内无任何表达。
　　2.10ng/ml TGF-β1处理ARPE-19细胞成功建立了视网膜色素上皮-间充质细胞转换体外模型。首先,随着TGF-β1作用时间的延长,ARPE-19细胞形态逐渐由鹅卵石样转变为长梭形的成纤维细胞样形态。其次,Real time-PCR结果显示Snail mRNA的相对表达量早在TGF-β1作用6h后即明显增加,48h达到高峰,表达量是Oh的9.84倍,持续至72h。同时,Real time-PCR结果证实间充质细胞标志物纤维粘连蛋白和α-肌动蛋白在mRNA水平的表达均随着TGF-β1作用时间的延长而明显增强,其表达增加与Snail mRNA的表达上调一致;而上皮细胞标志物E-钙粘素和闭锁小带1的表达则逐渐减少,其表达减少与Smil mRNA的表达趋势明显相反。WB从蛋白水平证实了以上Snail和上皮、间充质细胞标志物的表达变化。免疫荧光结果显示,正常ARPE-19细胞中E-钙粘素和闭锁小带1表达于细胞膜,纤粘连蛋白和α-肌动蛋白在胞浆中有很少量的表达。经TGF-β1处理不同时间后,E-钙粘素和闭锁小带1的表达逐渐减弱,至72h表达基本消失,而纤维粘连蛋白和α-肌动蛋白则在胞浆和细胞间大量沉积。外源性刺激条件下,转录因子只有在细胞核中才能发挥作用,因此我们通过免疫荧光技术调查了TGF-β1作用下Snail转录因子在ARPE-19细胞中的定位。结果显示TGF-β1处理48h后Snail蛋白大量表达于ARPE-19细胞的细胞核中,而未经TGF-β1处理的正常对照组中仅有极少量Snail蛋白表达于细胞浆,胞核中未见任何表达。
　　3.免疫荧光结果显示,稳定转染pSuper-Snail-shRNA的ARPE-19细胞经TGF-β1处理48h后细胞核内无Snail蛋白表达,而转染空载质粒的对照细胞中Snail蛋白明显表达于细胞核。Real time-PCR和WB分别从mRNA和蛋白水平证实,pSuper-Snail-shRNA转染组中Snail基因、纤维粘连蛋白和α-肌动蛋白的表达较对照组明显下降,而E-钙粘素和闭锁小带1的表达明显上调。另外,与转染pSuper-control的ARPE-19细胞相比,pSuper-Snail-shRNA组细胞表现为近似上皮细胞样形态。Tramwell迁移实验结果显示,与未经TGF-β1处理的pSuper-conlrol组细胞相比,TGF-β1明显增强pSuper-control组细胞的迁移能力;与TGF-β1处理的pSuper-control组细胞相比,TGF-β1处理过的pSuper-Snail-shRNA组细胞迁移能力明显下降,P＜0.05,具有统计学意义。
　　4.免疫荧光实验结果显示Snail转录因子在PVR患者视网膜前膜临床样本中阳性表达,并且分布于细胞核中。WB证实了Snail转录因子在视网膜前膜样本中的表达。
　　结论
　　1.首次报道ARPE-19细胞表达内源性Snail基因;Snail转录因子分布于ARPE-19细胞的胞浆中,细胞核中无表达。
　　2.采用TGF-β1处理ARPE-19细胞成功建立了视网膜色素上皮-间充质细胞转换体外模型。
　　3.TGF-β1上调ARPE-19细胞中Snail mRNA和蛋白的表达;TGF-β1处理能够激活Snail蛋白使其转移至细胞核发挥功能。
　　4.携带Snail基因短发夹结构转录单位的质粒pSuper-Snail-ShRNA有效沉默Snail基因后可逆转TGF-β1诱导的视网膜色素上皮-间充质细胞转换,而且影响ARPE-19细胞的生物学行为。
　　5.在PVR患者视网膜前膜临床样本中Snail基因高表达,其表达部位与in vitro实验一致,位于细胞核。

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