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人血小板冻干前负载海藻糖及冻干再水化后特性研究

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军医进修学院研究生学位论文原创性声明及军医进修学院研究生学位论文版权使用授权书

英文缩略词表

摘要

前言

第一部分人血小板冻干前负载海藻糖研究

第二部分可逆性血小板激活抑制剂的研究

第三部分血小板冻干再水化后特性初步研究

参考文献

小结

综述海藻糖及可逆性激活抑制剂在血小板冻干保存中的应用研究进展

附录

攻读学位期间发表文章

致谢

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摘要

目的；研究人血小板冻干前负载海藻糖技术与方法，筛选合适负载条件，可逆性抑制血小板激活，保护血小板功能。并以此检测血小板冻干再水化后特性。 方法；应用硫酸-蒽酮反应，定量检测载入到血小板胞内的海藻糖，绘制血小板胞内海藻糖浓度及负载效率随温度、时间、胞外海藻糖浓度变化曲线，制定出合适负载海藻糖条件。使用APACT-2型血小板聚集仪，分别检测小板负载海藻糖前后聚集反应性变化。使用流式细胞仪分别测定血小板在自身血浆和负载缓冲液中负载海藻糖前后、在含有和未含有DMSO(2％)溶液的缓冲液中负载海藻糖后，血小板膜表面糖蛋白CD62P、PAC-1的表达。应用硫酸-蒽酮反应，测定血小板在含有和未含有DMSO(2％)缓冲液中，37℃条件下，负载海藻糖4h后的胞内海藻糖浓度。用激光共聚焦荧光显微镜观察分析荧光黄CH(LYCH)被负载入血小板内的量及分布随DMSO(2％)的添加、负载温度、及负载时间变化的趋势。分别使用流式细胞仪和硫酸-蒽酮反应，测定分析不同浓度可逆性激活抑制剂PGE1和腺苷添加后，血小板膜表面CD62p、PAC-1的表达和血小板负载海藻糖效率。用血细胞计数仪检测再水化冻干血小板计数回收率随冻干液中胞外海藻糖、人血清白蛋白浓度、及室温放置时间的变化趋势。使用APACT-2型血小板聚集仪分别检测新鲜和再水化冻干血小板对四种不同浓度诱导剂的聚集反应，检测冻干液中胞内外海藻糖浓度对冻干再水化血小板聚集反应的影响。使用流式细胞仪分别检测分析胞内、外海藻糖浓度及低浓度DMSO溶液的添加对再水化冻干血小板膜表面CD62p、PAC-1表达的影响。用全自动血凝仪检测富含血小板血浆(PRP)冻干再水化后不稳定凝血因子Ⅷ和V活性变化。 结果；(1)建立了血小板胞内海藻糖提取和定量测定方法。37℃时，4h，胞外海藻糖浓度＜50mmol/L为冻干前血小板负载海藻糖合适条件。(2)血小板负载海藻糖前后聚集反应性无显著性差别(P＞0.05)。在含有可逆性激活抑制剂腺苷(5mmol/L)和PGE1(10μg/ml)的缓冲液中负载海藻糖4h后的血小板，同未含有抑制剂的对照组比较，其膜表面糖蛋白CD62p表达率显著降低，P＜0.05；PAC-1表达较稳定。(3)血小板在自身血浆中负载海藻糖前后，其膜表面CD62p、PAC-1的表达率未有显著性差别，p＞0.05；与血小板在缓冲液中负载海藻糖组比较，血小板在血浆中负载海藻糖4h后，CD62p表达率显著降低，P＜0.01。(4)负载液中添加DMSO组与未添加DMSO组比较，CD62p表达率显著降低，P＜0.01，PAC-1的表达恒定；载入胞内海藻糖浓度显著增高，P＜0.01；负载荧光黄LYCH后的血小板胞内LYCH浓度高，且分布均匀。(5)可逆性激活抑制剂-腺苷(5mM)，前列腺素E1(10μg/ml)显著抑制CD62p表达，提高海藻糖负载效率。(6)再水化冻干血小板计数回收率随冻干液中胞内外海藻糖及人血清白蛋白浓度不同而变化，室温放置8h后仍保持稳定。(7)新鲜血小板最大聚集率约达100％，再水化冻干血小板对凝血酶(1u/ml)、ADP(20μmol/L)、胶原(2μg/ml)、瑞斯托霉素(1.6mg/ml)最大聚集率分别达(69.6±3.9)％、(68.5±3.9)％、(65.5±3.9)％，(18±3.6)％。胞内外海藻糖组同胞外海藻糖组比较，再水化冻干血4板的最大聚集率分别为(66.0±4.69)％和(25.3±2.42)％，P＜0.01；CD62p表达率分别为(28.47±5.34)％和(39.23±7)％，P＜0.01。血小板在含有腺苷和PGE1冻干液中冻干再水化后，与对照组比较，CD62p表达率显著下降，P＜0.01。血小板在含有DMSO和未含有DMSO冻干液中冻干再水化后，CD62p表达率分别为(20.83±6.56)％和(40.88±11.0)％，P＜0.01；PAC-1的表达率分别为(0.96±0.86)％和(5.32±3.98)％，P＜0.05。(8)冻干前后PRP中不稳定凝血因子Ⅷ和V活性未有显著变化，P＞0.05。 结论；37℃，4h，胞外海藻糖浓度＜50mmo1/L为合适血小板负载海藻糖条件。与负载缓冲液相比，血浆可有效抑制血小板体外激活。腺苷(5mM)、前列腺素E1(10μg/ml)可逆性抑制血小板激活。2％DMSO显著促进血小板对海藻糖的吸收和胞内分布，在血小板冻干前后有效抑制血小板激活，保护血小板功能。再水化冻干血小板计数回收率较高，室温放置较稳定，聚集反应良好。海藻糖存在时，再水化冻干PRP中凝血因子活性保持稳定。

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