小鼠β防御素-6的克隆和鉴定、小鼠β防御素-4、6以及人β防御素-3在肺组织中的表达研究

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目的:(1)从小鼠肺组织里克隆mBD-6的cDNA。(2)观察肺组织中小鼠β-防御素-4、6的基因表达水平，探讨mBD-4、6在急性肺损伤发生发展中的作用。(3)研究小鼠β-防御素4、6在乳鼠和成年鼠肺部的表达和调控情况。(4)建立检测hBD-3mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法，对肺癌患者的癌组织、正常肺组织进行检测，从mRNA转录水平分析hBD-3基因在肺癌的表达，以便用于进行其与肺癌的关联性的探讨。方法:(1)提取大肠杆菌内毒素腹腔注射后小鼠肺组织的总RNA，反转录为cDNA作为模板，采用PCR的方法克隆小鼠β防御素-6基因。PCR产物连接入pGEM-EAST载体，转化JM109感受态细胞，蓝白筛选，对PCR鉴定含有目的片段的克隆进行测序。(2)将成年小鼠随机分为两组，一组为急性肺损伤组，一组为对照组。用大肠杆菌内毒素腹腔注射复制急性肺损伤模型，于不同时间点处死小鼠，采用Trizol法提取肺组织总RNA，实时荧光定量RCR检测肺组织beta-防御素-4、6基因在不同时间点的表达水平，测序鉴定PCR产物的特异性。(3)乳鼠与成年鼠各一组，用大肠杆菌内毒素腹腔注射两组小鼠，于不同时间点处死小鼠，采用Trizol法提取肺组织总RNA，实时荧光定量PCR检测肺组织beta-防御素-4、6基因在不同时间点的表达水平。(4)应用SYBRGreenI荧光定量技术，利用GAPDH作参照，建立检测hBD-3mRNA的实时荧光定量逆转录FQ-PCR方法，并检测13份正常肺组织和16份肺癌组织标本hBD-3mRNA的表达水平。结果:(1)获得预期大小的PCR产物，经序列鉴定证实为小鼠β防御素-6基因。(2)病理结果证实ALI动物模型复制成功。对照组肺组织中各时间点及ALI组6h点均无β-防御素-4、6基因表达。而ALI组12h、1d、3d时表达显著升高。(3)小鼠β-防御素-4、6mRNA在LPS刺激12h后的幼鼠和成年鼠肺组织中均有表达，荧光定量证实乳鼠LPS刺激后不同时间点肺组织β-防御素-4、6mRNA的表达量低于成年鼠，差异显著(P＜0.01)。(4)hBD-3在肺癌和正常肺组织中的表达有明显差别，说明肺癌组织中的hBD-3表达明显高于正常肺组织，其表达量为正常肺组织的3.31倍。结论:(1)获得了小鼠β防御素-6基因，为进一步构建表达载体，表达小鼠β防御素-6蛋白，获取其基因工程产品及临床抗感染治疗打下了基础，同时也为深入探讨小鼠β防御素-6的作用机制提供可能。(2)ALI上调肺组织中β-防御素-4、6基因的表达；β-防御素-4、6基因的诱导性表达可能通过参与“细胞网络”和“细胞因子网络”与ALI的发生发展有关。(3)本实验表明大肠杆菌内毒素可以诱导β-防御素-4、6在乳鼠和成年鼠肺部表达，β防御素-4、6在乳鼠和成年鼠肺组织中表达差异显著，说明此表达与小鼠年龄、发育有关。这些结果揭示当乳鼠细胞免疫防御系统还不成熟时，乳鼠肺部的先天免疫屏障作用也低于成年鼠。提示乳鼠肺组织β-防御素-4、6的诱导表达量低下可能是乳鼠免疫反应不成熟的部分表现。(4)建立的hBD-3mRNAFQ-PCR检测方法简便，特异好，可信度高，可用于hBD-3基因表达水平与肿瘤的关系研究。肺组织癌变诱导了hBD-3的表达。

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作者
田翠环;
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作者单位

解放军总医院;

解放军医学院;

军医进修学院;

中国人民解放军军医进修学院;

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授予单位解放军总医院;解放军医学院;军医进修学院;中国人民解放军军医进修学院;
学科呼吸内科
授予学位博士
导师姓名俞森洋;
年度 2005
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类肺疾病;呼吸器官生理;
关键词
β防御素; 实时荧光定量; 基因表达; 克隆; 肺组织;

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