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1.rDNA基因序列分析法鉴定真菌菌种;2.糠秕马拉色菌外分泌性蛋白分离及鉴定研究

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论文说明：中英文缩略语表

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课题一 摘要

课题一 英文摘要

课题二 摘要

课题二 英文摘要

rDNA基因序列分析法鉴定真菌菌种

前 言

第一部分 溶细胞酶结合Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA

第二部分 草茎点霉的鉴定及超微结构研究

第三部分 祖菲无绿藻碳水化合物变种的鉴定及表型研究

第四部分 真皮毛孢子菌的鉴定及生理、生化特征研究

第五部分 从1例声带感染组织内分离鉴定烟曲霉

课题一：结论

课题一：全文小结

课题二：糠秕马拉色菌外分泌性蛋白分离及鉴定研究

前言

第一部分 甘氨酸培养基的制备

第二部分 糠秕马拉色菌胞外酶活性测定

第三部分 用Api-Zym试剂盒分析糠秕马拉色菌胞外酶类型

第四部分 SDS-PAGE电泳分离糠秕马拉色菌细胞外分泌性蛋白

参考文献

课题二：全文结论

综述一：真菌的表型和rDNA序列分析在菌种鉴定中应用

综述二：致病真菌外分泌性蛋白研究进展

作者在读期间科研成果简介

致谢

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摘要

本文分为两个课题： 课题一、 rDNA基因序列分析法鉴定真菌菌种传统真菌菌种鉴定方法主要以表型特征为依据，即通过培养后观察菌落形态和显微特征，或辅以生理、生化、营养实验，但结果易受多种因素影响，或出现不能鉴定的情况。因此迫切需要建立一种稳定、可靠的真菌菌种鉴定方法。本研究包括以下五部分内容： 1．溶细胞酶结合Biospin真菌DNA提取试剂盒提取DNA 收集实验室保存菌株和临床分离真菌株，用溶细胞酶(lyticase)结合Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，A<,260>/A<,280>检测纯度并计算质量浓度，经PCR扩增检验所提取的DNA质量，即采用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增真菌核糖体RNA基因(ribosomal RNA gene，rDNA)内转录间区(internal transcribed spacers，ITS)。实验成功提取所有23株真菌基因组DNA，其纯度及质量浓度能满足PCR反应要求。用溶细胞酶结合Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒可以从酵母菌、无绿藻及丝状真菌提取DNA，所提取DNA可进一步用于PCR反应。为核糖体RNA基因序列扩增及序列分析奠定了基础。 2. 草茎点霉的鉴定及超微结构研究 形态学结合核糖体RNA内转录间区(internal transcribed spacers，ITS)核酸序列分析的方法，对上级部门下发的1株质控菌株进行鉴定；组织病理切片、扫描电镜及透射电镜观察孢子器结构。表型研究显示：该菌在37℃可生长，40℃不能生长。在燕麦培养基中生长可见黑色点状菌落及灰白色绒毛状菌丝，后期见棕红色色素扩散至培养基中。镜下见有孔的球形或透镜形的黑色分生孢子器及器孢子，鉴定为茎点霉(Phoma)；核糖体RNA基因(rDNA)内转录间区ITS序列分析，证明与草茎点霉(Phomaherbarum，P.herbarum)ATCC 22167 ITS区一致性为100％，鉴定为草茎点霉。超微结构见孢子从分生孢子器内壁产生。该研究显示：形态学是菌种鉴定的基础，形态学结合ITS区测序的方法，不仅可使该菌株的鉴定达到种的水平，同时两种方法的鉴定结果互相验证，以保证鉴定结果准确、可靠。 3. 祖菲无绿藻碳水化合物变种的鉴定及表型研究 根据形态学、生化特征，对1株分离自脑膜炎患者的无绿藻菌株进行菌种鉴定。该菌在25℃、40℃均可生长，沙堡弱培养基(SDA)、马铃薯培养基(PDA)见光滑湿润的白色酵母样菌落，镜下圆形、椭圆形厚壁孢子及裂殖成的圆形或不规则形内孢子。无菌丝、无子囊、无芽孢，鉴定为无绿藻。API 20C AU)(鉴定系统提示与威克汉姆无绿藻一致性为2.9％。选用不同引物进行PCR反应，扩增产物纯化后直接测序，通过核酸序列数据库进行同源性序列搜索及一致性比较鉴定菌种。NL1/NL4引物所扩增核糖体大亚基(LSU)26S rDNA D1/D2序列，与祖菲无绿藻碳水化合物变种(Prototheca zopfii var.hydrocarbonea)一致性为96％，提示祖菲无绿藻碳水化合物变种的可能性大；核糖体内转录间区ITS序列可能存在复杂结构，不适合该菌的测序鉴定；真核细胞核糖体小亚基(SSU)18S rDNA通用引物及无绿藻种属特异性引物PCR产物，同源性序列搜索，证明分离株与祖菲无绿藻碳水化合物变种18S rDNA有99.9％的碱基同源序列，故最终鉴定为祖菲无绿藻碳水化合物变种。形态学是菌种鉴定的基础，形态学结合核酸序列分析的方法，可使该菌株的鉴定达到种的水平，在所选择的测序片段中，SSU 18S rDNA比LSU 26S rDNA序列分析，更有利于该临床分离株的鉴定。 4. 真皮毛孢子菌的鉴定及生理、生化特征研究 采用沙堡弱培养基多点接种法，从1例29岁男性患者病甲中，分离出一株酵母样菌，做形态及．API 20 C AUX鉴定，PCR反应扩增核糖体RNA基因(rDNA)内转录间区(ITS)、基因间区1(intergenic spacer 1，IGS1)分析后，用BLAST软件分析法进行菌种鉴定。半定量Api-Zym系统分析细胞外酶活性。该菌株在37℃生长良好，40℃不能生长，镜下为关节孢子和真、假菌丝。尿素酶阳性，API 20 C AUX结果与粘质隐球菌(Cryptococcus humicolus)一致率78．9％，尚不能鉴定至种的水平。ITS、IGS1序列与GenBank公布的真皮毛孢子ITS和IGSl区一致率分别为99．8％和100％，鉴定为真皮毛孢子菌(Trichosporon dermatis)。Api-Zym细胞外酶活性试剂盒分析，碱性磷酸酶、酯酶、类脂酯酶、类脂酶、白氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、W-葡萄糖苷酶、N-乙酰．葡萄糖胺酶阳性。在形态学的基础上结合ITS、IGSl rDNA序列分析可鉴定真皮毛孢子菌。多种酶活性可能与其致病有关。 5．从1例声带感染组织内分离鉴定烟曲霉 对一例曲霉所致的声带感染，进行包括直接镜检、培养、病理、镜下形态、温度耐受实验等真菌学研究及28S rDNA、ITS区测序等系列研究，将病原菌鉴定为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。 课题二、糠秕马拉色菌外分泌性蛋白分离及鉴定研究 在真菌致病物质研究中，真菌分泌性蛋白的致病作用引起人们的关注。随着蛋白质分析技术的发展，蛋白质的分离及鉴定成为可能。该研究包括以下几个内容： 1. 制备甘氨酸为唯一氮源培养基，糠秕马拉色菌在其中生长，甘油及油酸两种脂源可以促进生长。 2. 收集培养上清，通过牛奶培养基分析法，分析上清酶活性，根据培养基成分被分解而形成的透明带，推测培养上清具有一定蛋白酶或类似蛋白酶活性。 3. 通过Api-Zym酶活性分析，显示不同培养条件下，细胞外酶类型有一定差异。其中生理盐水菌悬液检测出6种酶活性，包括不同种类的脂酶、白氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性。在甘氨酸培养条件下，检测出类脂酯酶、酸性磷酸酶活性。在不同培养条件下，均未检测出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶活性。 4. 用Quanticleave蛋白酶分析法，检测到改良甘氨酸培养上清具有一定蛋白酶活性。加入BSA的改良甘氨酸培养上清，蛋白酶含量升高，提示培养基中的蛋白成分可诱导蛋白酶产生。 5. 改良甘氨酸培养上清TCA沉淀后，经SDS-聚丙酰胺电泳进行蛋白初步分离，显示5条带，其中30 KD左右有两条带，丰度高。生理盐水菌悬液经超滤浓缩，SDS-聚丙酰胺电泳进行蛋白初步分离，显示5条带。但某些条带的分子量与改良甘氨酸上清来源的条带不同。

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