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递呈胸膜肺炎放线杆菌GalT蛋白的大肠杆菌外膜囊泡免疫效果评价

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摘要

缩略语表

综述

1.猪传染性胸膜肺炎疫苗研究进展

1.1 概述

1.2 疫苗研究

2.外膜囊泡递呈异源抗原研究进展

2.1 外膜囊泡研究背景

2.2 外膜囊泡递呈蛋白抗原

2.3 外膜囊泡递呈多糖抗原

研究目的意义

第一章 基因工程重组外膜囊泡的构建及验证

1材料

1.1 实验菌株与质粒

1.2 主要试剂耗材

1.3 主要仪器

2方法

2.1 重组质粒构建的引物设计

2.2 APP基因组DNA和c/yA模板质粒的提取

2.3 c/yA和ga/T片段的扩增

2.5 重组表达质粒向大肠杆菌JC8031的电转化

2.6 重组蛋白在JC8031中的表达鉴定

2.7 重组外膜囊泡的分离与鉴定

3结果

3.1 目的片段的扩增

3.2 重组表达质粒的酶切鉴定

3.3 SDS-PAGE及质谱检测融合蛋白

3.4 Western blotting检测融合蛋白表达

3.5 重组外膜囊泡的分离与鉴定

4分析讨论

4.1 关于外膜囊泡的分离与纯化

4.2 关于外膜囊泡的产量

5小结

第二章 重组外膜囊泡GalT-OMVs的免疫保护效力评价

1材料

1.1 实验菌株与质粒

1.2 主要试剂

1.3 实验仪器与耗材

1.4 实验动物

2方法

2.1 小鼠免疫程序

2.2 血清IgG效价测定

2.3 攻毒保护试验

2.4 脾脏淋巴细胞增殖试验

2.5 细胞因子测定

2.6 组织病理学分析

2.7 免疫组化分析

3结果

3.1 小鼠血清特异性IgG效价测定

3.2 免疫保护结果

3.3 脾脏淋巴细胞增殖

3.4 淋巴细胞培养上清中细胞因子含量

3.5 组织病理学分析结果

3.6 免疫组织化学分析结果

4分析讨论

4.1 关于外膜囊泡的应用

4.2 关于外膜囊泡疫苗的安全性

5小结

结论

参考文献

致谢

作者简历

附录

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摘要

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的病原菌,每年给全球养猪业造成巨大的经济损失。本研究旨在利用大肠杆菌外膜囊泡(OMVs)递呈APP GalT蛋白,并对其免疫效果进行研究,初步探索其作为新型候选疫苗的潜力。首先,成功构建了能表达APP GalT蛋白的重组大肠杆菌。以大肠杆菌JC8031作为表达菌,pBAD18-Cm作为表达载体,先后将clyA(909bp)和galT(1050bp)基因片段连入载体中,经终浓度为0.2%L-阿拉伯糖诱导5h后,重组大肠杆菌能够表达由ClyA和GalT组成的融合蛋白,大小约为75KD。其次,成功建立了递呈APP GalT蛋白的大肠杆菌OMVs制备方法。诱导20h后的重组大肠杆菌首先经低速离心分离上清,随后使用分子截留量为100KD的超滤管对上清液进行浓缩,再经120,000×g超速离心3h分离沉淀后得到大肠杆菌外膜囊泡悬液。分离到的大肠杆菌外膜囊泡直径在20-150nm之间;Western-blotting鉴定显示重组外膜囊泡中APP GalT蛋白。最后,证明了递呈APP GalT蛋白的OMVs具有较好的APP免疫保护效果。以重组外膜囊泡免疫小鼠,对其进行了体液免疫、细胞免疫、攻毒保护率及病理变化等方面的评价。结果显示免疫后的小鼠可以产生高效价的特异性IgG抗体(1∶204800);淋巴细胞增殖水平和细胞因子分泌水平显著上升;攻毒试验结果表明在主动免疫和被动免疫中重组外膜囊泡可分别起到87.5%和50%的保护率;肺脏病理分析和免疫组织化学结果显示重组外膜囊泡可明显减轻小鼠攻毒后肺脏病变程度和中性粒细胞浸润情况。

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