Myostatin负调控成肌细胞增殖和分化的信号转导机制研究

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肌肉生长抑制素(Myostatin)，简称肌抑素，属TGF-β超家族的一员，它是骨骼肌生长发育的负调控因子。本研究旨在以小鼠成肌细胞系C2C12细胞为模型，探讨Myostatin负调控成肌细胞增殖和分化的c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号途径。本研究共包括以下五部分实验：实验一Myostatin对JNK信号途径的影响在掌握C2C12细胞生长特性的基础上，为体外研究Myostatin是否对JNK信号途径产生影响并确定其最佳添加浓度，首先利用不同浓度的重组鼠Myostatin蛋白处理C2C12细胞，1h后收集细胞提取总蛋白，利用磷酸化JNK抗体进行Westernblot分析。结果表明，添加50ng/mL重组鼠Myostatin蛋白组的杂交信号最强。确定最佳添加浓度后，为进一步研究细胞在增殖和分化过程中Myostatin是否对JNK信号途径产生影响及了解这种影响是否具有时间效应，分别在增殖和分化两种培养条件下利用50ng/mL重组鼠Myostatin蛋白处理C2C12细胞不同时间，然后在不同时间点收集细胞提取总蛋白，利用多种抗体进行Westernblot分析。结果表明：增殖过程中，细胞内JNK磷酸化水平在Myostatin作用20min出现轻微提高，在1h达到最大，随后逐渐下降；分化过程中，细胞内JNK磷酸化水平在Myostatin作用20min出现第一次提高，在40min回落到对照组水平，在1h后出现第二次提高并持续到4h；细胞增殖和分化过程中，Myostatin激活JNK这一事件被Myostatin激活c-Jun(JNK信号途径下游信号分子)进一步所证实，并且细胞内c-Jun磷酸化水平的变化具有与JNK磷酸化水平变化相类似的规律；细胞增殖和分化过程中，JNK总蛋白水平在各处理前后维持恒定。本实验首次证实了C2C12细胞增殖和分化过程中Myostatin能够激活JNK信号途径。实验二ActRⅡB在Myostatin激活JNK中的作用为获得能够有效下调ActRⅡB基因表达的小干扰RNA(siRNA)分子，采用阳性对照GAPDHsiRNA确定的最佳脂质体转染条件，将三对用于下调ActRⅡB基因表达的siRNA(AmbionsiRNAID59935、ID60120或ID162114)转染到C2C12细胞中，48h后收集细胞提取总RNA，利用实时荧光定量PCR方法分析细胞内ActRⅡB基因表达的变化。结果表明：和对照组相比，AmbionsiRNAID59935、ID60120和ID162114分别下调了细胞内ActRⅡB基因的mRNA表达水平46.68％、27.46％和60.92％。为研究Myostatin激活JNK是否由ActRⅡB所介导，采用最佳脂质体转染条件，将AmbionsiRNAID162114转染到C2C12细胞中，48h后添加50ng/mL重组鼠Myostatin蛋白处理1h，然后收集细胞提取总蛋白，利用磷酸化JNK抗体进行Westernblot分析。结果表明，有效下调ActRⅡB基因表达后，Myostatin激活JNK的程度受到显著地削弱。本实验证实了Myostatin激活JNK是由ActRⅡB所介导。实验三TAK1-MKK4信号通路在Myostatin激活JNK中的作用为获得能够高效下调TAK1和MKK4基因表达的小干扰RNA(siRNA)分子，采用最佳脂质体转染条件，分别将三对用于下调TAK1基因表达的siRNA(AmbionsiRNAID94455、ID94549或ID189006)和三对用于下调MKK4基因表达的siRNA(AmbionsiRNAID64447、ID64539或ID186583)转染到C2C12细胞中，48h后收集细胞提取总RNA，利用实时荧光定量PCR方法分析细胞内TAK1和MKK4基因表达的变化。结果表明：和对照组相比，AmbionsiRNAID94455、ID94549和ID189006分别下调了细胞内TAK1基因的mRNA表达水平33.34％、46.73％和79.97％，AmbionsiRNAID64447、ID64539和ID186583分别下调了细胞内MKK4基因的mRNA表达水平85.19％、79.18％和69.59％。为研究Myostatin激活JNK是否由TAK1和MKK4所介导，采用最佳脂质体转染条件，分别将AmbionsiRNAID189006或AmbionsiRNAID64447转染到C2C12细胞中，48h后添加50ng/mL重组鼠Myostatin蛋白处理1h，然后收集细胞提取总蛋白，利用多种抗体进行Westernblot分析。结果表明，高效下调TAK1基因表达后，JNK被Myostatin激活的程度受到削弱，而高效下调MKK4基因表达后，JNK几乎不被Myostatin所激活。以上结果表明，Myostatin是通过TAK1-MKK4信号通路而激活JNK。实验四JNK信号途径在Myostatin负调控成肌细胞增殖和分化中的作用采用MTT法进行细胞增殖分析，结果表明：和对照组相比，添加50ng/mL重组Myostatin蛋白处理C2C12细胞24h抑制了细胞增殖约20％(P=0.28)，而添加10μmol/LJNK特异性抑制剂SP600125阻断JNK信号途径后，Myostatin则失去了抑制细胞增殖的能力。Myostatin抑制成肌细胞增殖常与p21基因表达上调密切相关。为检测细胞增殖过程中Myostatin是否对p21基因表达产生影响，实验对80％左右汇合的C2C12细胞用50ng/mL重组鼠Myostatin蛋白分别处理2h、4h和6h。实时荧光定量PCR结果表明，Myostatin上调p21基因表达最佳作用时间为4h。为检测细胞增殖过程中JNK是否在Myostatin上调p21基因表达中发挥作用，实验对80％左右汇合的C2C12细胞用10μmol/LSP600125预先处理1h后，再用50ng/mL重组Myostatin蛋白处理4h。实时荧光定量PCR结果表明，p21基因表达mRNA水平在Myostatin处理4h后上调了约3.5倍，而存在SP600125时，Myostatin上调p21基因表达的能力则受到一定程度的削弱。Westernblot分别结果表明，p21基因表达蛋白水平的变化与其mRNA水平的变化类似。Myostatin抑制成肌细胞分化常与分化相关基因表达下调密切相关。为检测JNK是否在Myostatin下调分化相关基因表达中起作用，C2C12细胞在增殖培养液生长至80％左右汇合时，更换为分化培养液继续培养24h，然后于分化培养条件下用10μmol/LSP600125预先处理1h后，再用50ng/mL重组Myostatin蛋白处理24h，分别利用实时荧光定量PCR和Westernblot分析分化标志基因myogenin和MyoD基因表达mRNA和蛋白水平的变化。结果表明，myogenin基因表达mRNA和蛋白水平分别在Myostatin处理24h后下调了40％和80％，MyoD基因表达mRNA和蛋白水平分别在Myostatin处理24h后下调了25％(P=0.13)和63％，而存在SP600125时，Myostatin下调myogenin和MyoD基因表达的能力均受到一定程度的削弱。以上结果表明，JNK信号途径在Myostatin负调控成肌细胞增殖和分化中发挥了重要作用。实验五MKK4siRNA对Myostatin下调分化相关基因表达的影响在分化培养条件下AmbionsiRNAID64447依然能够高效下调MKK4基因表达的前提下，采用最佳脂质体转染方法，将MKK4基因特异的siRNA(AmbionsiRNAID64447)转染到C2C12细胞中，48h后更换成含50ng/mL重组鼠Myostatin蛋白的分化培养液再培养48h，然后收集细胞提取总蛋白，利用多种抗体进行Westernblot分析。结果表明，细胞内myogenin和MyoD蛋白水平在Myostatin作用48h分别下降了82.54％和90.02％，但采用RNAi显著下调MKK4基因表达后细胞内myogenin和MyoD蛋白水平在Myostatin作用48h只分别下降了40.42％和24.38％。本实验一方面进一步证实了JNK信号途径在Myostatin负调控成肌细胞分化中发挥了重要的作用，另一方面为寻求下调Myostatin活性提供了有益的思路。总之，本研究首次揭示了Myostatin负调控成肌细胞增殖和分化的JNK信号途径。首先，本研究证实了C2C12细胞增殖和分化过程中Myostatin能够激活JNK信号途径。其次，本研究证实了Myostatin是通过ActRⅡB受体再通过TAK1-MKK4信号通路而激活JNK。最后，本研究证实了激活的JNK信号途径在Myostatin负调控成肌细胞增殖和分化中发挥了重要作用。此外，本研究发现显著下调MKK4基因的表达能明显削弱Myostatin下调分化相关基因表达的能力，这为寻求下调Myostatin活性提供了有益的思路。

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作者
黄志清;
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作者单位

四川农业大学;

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授予单位四川农业大学;
学科动物营养与饲料科学
授予学位博士
导师姓名陈代文;
年度 2008
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正文语种中文
中图分类家畜生理学、生物物理学、生物化学;
关键词
肌肉生长抑制素; 负调控因子; 细胞增殖; 信号转导; 转导机制; 细胞分化; 成肌细胞;

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