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不同理化条件及内生菌对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系细胞生物量和绿原酸含量产生的影响

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摘要

第一章 不同理化条件对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’生物量和绿原酸含量的影响

1.1 引言

1.2 材料与方法

1.2.1 材料

1.2.2 培养基的配置

1.2.3 悬浮培养体系的建立

1.2.4 生长曲线的确定

1.2.5 外源激素对生物量和绿原酸含量的影响

1.2.6 糖源对生物量和绿原酸含量的影响

1.2.7 pH对生物量和绿原酸含量的影响

1.2.8 接种量对生物量和绿原酸含量的影响

1.2.9 不同量的培养基对生物量和绿原酸含量的影响

1.2.10 代谢前体物对生物量和绿原酸含量的影响

1.2.11 B5培养基中主要矿质元素对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮培养体系中细胞的生长和绿原酸含量的影响

1.2.12 生物量的测定和绿原酸的提取

1.2.13 HPLC检测与数据分析

1.3 结果与分析

1.3.1 愈伤组织的诱导及悬浮培养体系的建立

1.3.2 HPLC对绿原酸的定性和定量

1.3.3 灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮细胞生长曲线及次级代谢物绿原酸积累曲线

1.3.4 外源激素对生物量和绿原酸含量的影响

1.3.5 不同浓度的蔗糖对生物量和绿原酸含量的影响

1.3.6 不同pH对生物量和绿原酸含量的影响

1.3.7 不同的接种量对生物量和绿原酸含量的影响

1.3.8 不同量的培养基对生物量和绿原酸含量的影响

1.3.9 苯丙氨酸对生物量和绿原酸含量的影响

1.3.10 B5培养基中主要矿质元素对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮培养体系中细胞的生长和绿原酸含量的影响

1.4 讨论

1.4.1 不同的培养条件灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系生物量和绿原酸含量的影响

1.4.2 代谢前体物苯丙氨酸对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系生物量和绿原酸含量的影响

1.4.3 不同无机盐对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系生物量和绿原酸含量的影响

第二章 灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’内生菌对其悬浮细胞生物量及绿原酸含量的影响

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 培养基的配置

2.2.3 内生菌的分离

2.2.4 内生菌的鉴定

2.2.5 内生菌诱导子的制备

2.2.6 内生菌诱导子对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮细胞生物量和绿原酸含量的影响

2.3 结果与分析

2.3.1 内生菌的分离

2.3.2 菌种鉴定

2.3.3 cc2对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮培养体系中细胞的生长和绿原酸含量的影响

2.3.4 cc4对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮培养体系中细胞的生长和绿原酸含量的影响

2.3.5 cc5对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮培养体系中细胞的生长和绿原酸含量的影响

2.3.6 cc13对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮培养体系中细胞的生长和绿原酸含量的影响

2.3.7 cc14对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮培养体系中细胞的生长和绿原酸含量的影响

2.3.8 cc15对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮培养体系中细胞的生长和绿原酸含量的影响

2.4 讨论

第三章 文献综述

参考文献

致谢

在校期间的科研成果

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摘要

灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’为忍冬科忍冬属植物,是传统药用植物金银花的新品种之一,具有较高的药用价值。与传统的忍冬科植物相比,灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’产量较高、抗逆性较强等,更为重要的是其次级代谢产物绿原酸含量较高。而绿原酸作为金银花质量成分的主要指标,具有较高的生物药用活性,目前大多从植物源材料中提取,供不应求。本研究试图优化灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系理化条件,并向悬浮体系中添加不同的内生菌作为诱导子,以期提高绿原酸产量,为绿原酸的工业化生产打下基础。
  (1)优化灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系理化条件。以灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’为外植体,诱导并获得适宜的愈伤组织,建立适宜的悬浮体系。分析不同理化条件对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系生物量和绿原酸含量的影响,以期达到提高绿原酸含量的目的。实验结果表明:灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系最佳理化条件为:培养时间15d、pH为5.5、蔗糖量为30-40g·L-1、接种量为50 g·L-1、接种在全量B5培养基中。同时,对于附加的激素而言:单一激素中2.0mg·L-1的6-BA可以有效的提高‘渝蕾1号’悬浮体系生物量和绿原酸含量;而混合激素中,6-BA2.0 mg·L-1+2,4-D0.5 mgL-1可以使绿原酸的积累最多,6-BA2.0mg·L-1+2,4-D2.0 mg·L-1可以使生物量达到最大。对于苯丙氨酸来说,当苯丙氨酸浓度大于50 mg·L-1时,均有利于绿原酸的积累。此外,无机盐对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系产生的影响表明,NO3-/NH4+摩尔比值为13∶1时,有利于细胞的生物量和绿原酸的积累;KNO3在较高浓度(3.5 g·L-1)时,生物量可取得最大值,在较低浓度(0.5-1.5 g·L-1)时,积累的绿原酸较多;(NH4)2SO4浓度在0.268g·L-1时,绿原酸和生物量均取得最大值;0.1 g·L-1的NaH2PO4·2H2O和0.2 g·L-1的CaCl2均有利于细胞生物量和绿原酸的积累;对于MgSO4.7H2O来说,低浓度有利于细胞的生长,高浓度促进绿原酸的积累,兼顾生物量和绿原酸的积累量,应选择适中的浓度。
  (2)内生菌对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系产生的影响。实验从‘渝蕾1号’外植体中分离纯化获得17种内生菌,并通过16S rDNA和18S rDNA分子鉴定结合形态特征鉴定出6株内生菌,分别是根瘤菌(cc2)、荧光假单胞菌(cc4)、盾壳霉菌(cc5)、高地芽孢杆菌(cc13)、同温层芽孢杆菌(cc14)以及短小芽孢杆菌(cc15)。研究表明,6种内生菌均不同程度的影响着‘渝蕾1号’悬浮体系生物量的含量和绿原酸的积累。对于生物量来说,6种内生菌浓度均在25mg·L-1时,生物量取得最大值。而对于绿原酸的积累量来说,根瘤菌、荧光假单孢菌、盾壳霉菌及同温层芽孢杆菌均在浓度为25mg·L-1时,绿原酸含量达到最大,而高地芽孢杆菌和短小芽孢杆菌在浓度为12.5mg·L-1时,绿原酸含量达到最大。
  综上所述,本研究对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系理化条件进行了优化,并揭示了灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’内生菌的种类及与次级代谢物绿原酸的关系。目的均在于提高绿原酸的产量,为绿原酸的工业化生产奠定基础。

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