声明
第一章 文献综述
1.1 人参皂苷生物合成研究进展
1.1.1 PPD分子结构及其生理活性
1.1.2 PPD与达玛烷型人参皂苷
1.1.3 PPD与人参皂苷生物途径探索与合成基因挖掘
1.1.4 PPD异源合成
1.2工程化酿酒酵母合成萜类化合物的研究进展
1.2.1 MVA途径及萜类合成途径优化
1.2.2提高胞质乙酰辅酶A供应
1.2.3酿酒酵母产萜类化合物辅因子代谢调控
1.2.4细胞色素P450单加氧酶在酿酒酵母中的表达
1.3 13C代谢通量分析在酿酒酵母代谢工程中的应用
1.4 本论文的主要研究内容
本论文研究内容的技术路线图
第二章 PPD合成途径重构与P450氧化系统优化
前言
2.1 实验材料和方法
2.1.1 菌株、载体
2.1.2构建合成PPD的酿酒酵母细胞
2.1.3 PPDS-ATR1融合蛋白的构建
2.1.4 qPCR定量测定PPDS和ATR1在基因组上的拷贝数
2.1.5 酵母胞内ROS水平的测定
2.1.6 PPDS含量测定-CO示差分析
2.1.7测定PPDS和ATR1氧化体系的催化活力和耦合效率
2.1.8酵母培养和发酵过程
2.1.9代谢物提取和分析
2.2 实验结果与讨论
2.2.1 酿酒酵母合成DMD和PPD问题初探
2.2.2 电子自给的PPDS-ATR1融合蛋白构建
2.2.3 PPDS-ATR1融合蛋白linker长度对活性的影响
2.2.4 PPDS氧化系统的活性测定和耦合效率分析
2.2.5 W3和W3a菌株发酵生产PPD
2.3本章小结
第三章 提高酿酒酵母乙醇和ROS的耐受性以增强PPD合成能力
前言
3.1 实验材料和方法
3.1.1 菌株、质粒和培养基
3.1.2 ROS测定方法
3.1.3增强乙醇耐受性的基因筛选
3.1.4 调控YBP1基因表达
3.1.5细胞活性测定
3.1.6酵母工程菌株对乙醇和ROS耐受能力的测定
3.1.7细胞壁完整性检验
3.1.8氧化应答基因TRX2，SOD1，GSH1和GLR1的表达分析
3.1.9酵母的培养及发酵工艺
3.1.10葡萄糖和乙醇的定量
3.1.11 OD600测定
3.1.12 PPD的提取和分析
3.2 实验结果与讨论
3.2.1 PPDS-ATR1释放ROS增加工程菌对乙醇的敏感性
3.2.2 高表达SSD1和YBP1提高细胞活力
3.2.3 细胞壁完整性分析以及氧化压力相应基因表达分析
3.2.4 工程菌株W3a和W3a-ssPy的摇瓶发酵实验
3.2.5基于碳源控制的双阶段补料发酵
3.3本章小结
第四章 工程改造酿酒酵母利用乙醇高效合成PPD
前言
4.1 实验材料和方法
4.1.1 菌株、载体和培养基
4.1.2乙醇诱导启动子表达分析
4.1.3 TetR-TetO调控系统用于ERG7启动子改造
4.1.4绿色荧光蛋白的相对强度测定
4.1.5 PPD生产菌株重构
4.1.6 MVA途径优化
4.1.7三萜途径的平衡以及与甾醇途径竞争性协调与优化
4.1.8 提高胞质乙酰辅酶A供应
4.1.9 13C通量分析
4.1.10发酵过程
4.1.11 OD600和乙醇浓度测定
4.1.12有机酸HPLC测定
4.1.13 FOH、鯊烯、2,3-氧化鲨烯和2,3;22,23-双氧化鯊烯的细胞合成与鉴定
4.1.14三萜及甾醇类测定
4.2 实验结果与讨论
4.2.1 乙醇做单一碳源时的强启动子筛选
4.2.2 PPD生产菌株的重构与MVA途径的优化
4.2.3三萜合成途径的代谢平衡
4.2.4三萜途径与甾醇途径的竞争调节
4.2.5 提高胞内乙酰辅酶A供应
4.2.613C代谢通量分析菌株W3a-ssPy和WLT-MVA5代谢差异
4.2.7 发酵过程控制
4.3 本章小结
第五章 PPD酿酒酵母生产的整合生物过程设计
前言
5.1 实验材料与方法
5.1.1 PPD微生物生产的整合生物过程设计
5.1.2 5 L罐发酵过程
5.1.3优化通气速率
5.1.4发酵过程中检测PPD合成
5.1.5树脂的提取与洗脱
5.1.6 PPD收率计算
5.1.7 OD600和乙醇含量测定
5.1.8 PPD产品纯度分析
5.1.9 代谢产物的HPLC和LC-MS分析
5.2 实验结果与讨论
5.2.1 乙醇补料发酵过程
5.2.2优化通气速率提高PPD转移效率
5.2.3罐B中的PPD提取
5.2.4 优化树脂层析过程
5.2.5整合生物过程操作
5.3本章小结
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
附件
攻读博士期间成果总结与参与项目
致谢
