大肠杆菌好氧发酵生产苹果酸的代谢工程研究

声明

第一章 文献综述

1.1苹果酸的理化性质

1.2 L-苹果酸的用途

1.3 苹果酸的化学合成法

1.4苹果酸的生物合成法

1.4.1 苹果酸天然生产菌株

1.4.2 代谢工程菌株

1.4.3 两步发酵法产 L-苹果酸的研究进展

1.5选题背景和研究内容

1.5.1苹果酸的应用前景

1.5.2甘油及其利用

1.5.3 主要研究内容

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验菌株和质粒

2.1.2 实验相关仪器

2.1.3 实验药品

2.1.4 溶剂和培养基配制

2.2 实验方法

2.2.1引物设计和基因测序

2.2.2 琼脂糖凝胶电泳

2.2.3 DNA片段的回收

2.2.4 PCR产物的纯化

2.2.5 DNA的酶切、去磷酸化和连接

2.2.6 大肠杆菌电转感受态细胞的制备与转化

2.2.7大肠杆菌染色体DNA的提取

2.2.8 大肠杆菌质粒的提取

2.2.9 大肠杆菌基因的敲除

2.2.10菌株的培养及发酵

2.2.11 葡萄糖的测定

2.2.12 发酵产物的测定

2.2.13 酶活的测定

第三章 实验结果与讨论

3.1好氧苹果酸生产菌株的构建

3.1.1 PEP羧化酶基因ppc启动子的置换

3.1.2苹果酸酶maeA的敲除

3.1.3苹果酸酶maeB的敲除

3.1.4 苹果酸脱氢酶mdh的敲除

3.1.5 苹果酸脱氢酶mqo的敲除

3.1.6组合基因的敲除

3.1.7三基因敲除菌株的构建

3.1.8四基因敲除菌株的构建

3.2 苹果酸理论最大得率的计算

3.2.1 以甘油为底物生产苹果酸理论得率计算

3.2.2 以葡萄糖为底物生产苹果酸理论得率计算

3.3 工程菌株发酵结果分析

3.3.1 以甘油为底物进行发酵的结果

3.3.2 苹果酸脱氢酶mdh基因序列测定

3.3.3苹果酸脱氢酶 MDH 的酶活力测定

3.3.4羧化途径增强对苹果酸积累的影响

3.3.5 以葡萄糖为底物进行发酵的结果

第四章 结论与展望

4.1 实验结论

4.2 展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

发表的论文

参与的科研项目

致谢