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非伤寒沙门菌伤寒毒素基因分子流行病学研究

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目的： 对非伤寒沙门菌（NTS）临床分离株中伤寒毒素（TT）编码基因tt进行分子流行病学研究，检测和分析cdtB、pltA和pltB基因在NTS不同血清型与不同PFGE型别菌株中的携带情况与序列特点，并与GenBank中收录的其他国家地区分离的cdt/tt阳性菌株进行对比分析，为进一步探索cdt/tt基因的播散、流行、进化规律和tt基因阳性NTS菌株对人体的影响与危害提供依据。 方法： 1、沙门菌tt基因的PCR扩增检测：实验菌株为2014年5-10月分离自天津医科大学第二医院和天津医科大学总医院肠道门诊急性腹泻患者粪便标本的108株非重复NTS，采用特异引物PCR扩增cdtB、pltA和pltB基因。 2、PFGE分析：对108株NTS提取全基因组DNA，经限制性内切酶XbaⅠ酶切后进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析。 3、tt基因PCR产物序列分析：在tt基因阳性的各血清型中，每种PFGE型别都挑选1株，对其cdtB、pltA/B基因扩增产物进行DNA双向测序，Blast分析DNA和氨基酸序列，并与GenBank收录的cdt/tt阳性菌株对比。 4、tt基因氨基酸进化树分析：采用MEGA5软件构建本研究和GenBank收录的tt阳性沙门菌株CdtB、PltA、PltB的氨基酸序列系统进化树，进行分析。 结果： 1、在108株NTS中有20株（18.5%）同时检测到了tt基因cdtB、pltA/B，包括3株黄金海岸沙门菌（S.Goldcoast）、16株胥伐成格隆沙门菌（S.Schwarzengrund）和1株埃森沙门菌（S.Essen），其它NTS菌株未检测到tt基因cdtB、pltA/B中的任何1种。3株黄金海岸沙门菌分属3个不同的PFGE型别，16株胥伐成格隆沙门菌也有3个不同型别。 2、选取3株不同PFGE型别的黄金海岸沙门菌、3株不同PFGE型别的胥伐成格隆沙门菌和1株埃森沙门菌共7株菌的cdtB、pltA、pltB基因PCR产物测序，它们的开放阅读框（ORF）长度依次为810bp、729bp和414bp，各编码269AA、243AA、140AA长的多肽链。该7株菌CdtB氨基酸序列中都包含GenBank收录的伤寒沙门菌CT18的CdtB亚基两个功能保守位点His-160（催化作用位点）和ASP-195（Mg2+结合位点）。 3、3株不同PFGE型别的黄金海岸沙门菌cdtB、pltA/B的序列完全相同，与伤寒沙门菌CT18相应基因DNA序列相似性依次为99.51%、99.04%、97.34%，氨基酸序列相似性依次为99.26%、99.59%、97.81%。 4、3株不同PFGE型别的胥伐成格隆沙门菌、1株埃森沙门菌与GenBank收录的分离自美国的胥伐成格隆沙门菌CVM19633的cdtB、pltA/B序列完全相同。它们与伤寒沙门菌CT18相应基因DNA序列相似性依次为99.88%、98.63%、96.86%，氨基酸序列相似性依次为100.00%、98.76%、95.62%。 5、GenBank收录的甲型副伤寒沙门菌ATCC9150在CdtB氨基酸进化树中单独成簇，但在PltA和PltB氨基酸进化树中与本研究中的黄金海岸沙门菌聚为一簇。伤寒沙门菌CT18和爪哇那沙门菌CFSAN001992在PltA和PltB氨基酸进化树中各自单独成簇，但在CdtB氨基酸进化树中与本研究中的胥伐成格隆沙门菌、埃森沙门菌和美国分离的胥伐成格隆沙门菌CVM19633聚为一簇。 6、甲型副伤寒沙门菌ATCC9150与本研究中的黄金海岸沙门菌PltA和PltB氨基酸序列完全相同，但CdtB序列有3个氨基酸差异。与此同时，甲型副伤寒沙门菌ATCC9150和鼠伤寒沙门菌Sal199的CdtB氨基酸序列完全相同，但PltA有1个氨基酸差异、PltB有2个氨基酸差异。 7、本研究中tt基因阳性NTS菌株与GenBank收录的大肠埃希菌Vir68等cdt基因阳性革兰阴性菌CdtB氨基酸序列相似性均低于50%，PltA/B与这些菌株CdtA/C氨基酸序列相似性更低，不足20%。 结论： 1、本地区临床分离的埃森沙门菌、胥伐成格隆沙门菌和黄金海岸沙门菌检测到了tt基因cdtB、pltA/B，其中黄金海岸沙门菌携带tt基因未见公开报道。 2、本研究中NTS的tt基因与伤寒沙门菌相比，虽有一定的多态性但相似性很高，并且CdtB氨基酸序列都具有功能保守位点。 3、TT关键亚基CdtB序列呈现一定程度的血清型依赖性，同一血清型不同PFGE型别菌株或不同地区相同血清型菌株CdtB序列可以完全一致。 4、沙门菌不同血清型菌株之间CdtB亚基和PltA/B亚基的进化演变可能是相互独立的。

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