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抗CD40×HER2双特异性单链抗体的构建及抑制肿瘤增殖的实验研究

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、抗CD40高亲和力单链抗体克隆的筛选

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、抗CD40×HER2双特异性单链抗体的构建及蛋白表达

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、抗CD40×HER2双特异性单链抗体免疫激活功能验证

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

四、 抗CD40×HER2双特异性单链抗体HER2靶向功能验证

4.1对象和方法

4.2结果

4.3 讨论

4.4小结

全文结论

展望

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:抗体类药物在恶性肿瘤治疗中的应用

致谢

个人简历

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摘要

目的：采用基因重组及蛋白原核表达技术获取抗CD40×HER2双特异性单链抗体（CD40×HER2 Single chain Diabody, CD40×HER2 ScDb），并检测其激活肿瘤特异性免疫及HER2分子靶向的功能。
　　方法：使用固相筛选法对抗CD40噬菌体展示免疫文库进行筛选，并通过噬菌体ELISA最终筛选获取高亲和力抗CD40 ScFv克隆。以此为模板，PCR扩增获取CD40 ScFv的重链可变区（heavy chain variable, VH）及轻链可变区（light chain variable, VL）序列，通过重叠PCR（Overlap Extension OE-PCR）将CD40 ScFv的VH及VL分两步与HER2 ScFv基因片段进行拼接获取CD40×HER2 ScDb序列全长，DNA电泳及测序检测拼接序列的正确性。使用Nde I及Sal I进行CD40×HER2 ScDb序列及pET28a原核表达载体的酶切并构建pET28a-CD40×HER2 ScDb原核表达载体。将构建的重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞，IPTG诱导蛋白表达，超声裂解诱导菌体，Ni-NTA琼脂糖纯化获取CD40×HER2 ScDb，并对其进行理化性质的分析及分子结构预测。体外诱导培养小鼠骨髓源树突状细胞，流式细胞术检测CD40×HER2 ScDb对树突状细胞表面CD80/CD86及MHC-II表达的影响。依据给予的干预不同，实验分为：生理盐水（Normal Saline，NS）对照组；单纯肿瘤抗原负载（Ag）组；Ag+CD40×HER2 ScDb组以及Ag+TNF-α组4组。ELISA检测CD40×HER2 ScDb对树突状细胞分泌IL-12的影响以及对T淋巴细胞分泌 IFN-γ的影响。体外培养小鼠乳腺癌细胞系4T1，CCK8检测CD40×HER2 ScDb诱导的肿瘤特异性T淋巴细胞对4T1增殖的抑制作用。构建4T1细胞系的BALB/c小鼠肿瘤模型，依据给予的不同干预，将模型小鼠随机分为：NS组；HER2 ScFv组；CD40×HER2 ScDb1组（750μg/kg）；CD40×HER2 ScDb2组（1.5mg/kg）及CD40mAb（5mg/kg）组。记录并描绘各组肿瘤生长曲线，ELISA检测肿瘤组织中IL-12、IFN-γ的表达水平。对肿瘤组织进行石蜡包埋切片，HE染色检测肿瘤组织淋巴细胞浸润，免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）检测肿瘤细胞Caspase-3的表达水平。体外培养小鼠成纤维瘤细胞系T6-17细胞系，细胞免疫荧光检测CD40×HER2 ScDb对HER2的靶向功能，CCK8实验检测CD40×HER2 ScDb对T6-17细胞的体外杀伤。依据给予的干预不同，实验分组为：NS组；CD40 ScFv组（2.5μg/mL）；HER2 ScFv组（2.5μg/mL）；CD40×HER2 ScDb1组（2.5μg/mL）；CD40×HER2 ScDb2组（5μg/mL）；曲妥珠单抗组（15μg/mL）。构建T6-17细胞的BALB/c-Nude小鼠肿瘤模型，依据给予的干预不同，将模型小鼠随机分为：NS组；CD40 ScFv组（150μg/kg）；HER2 ScFv组（150μg/kg）；CD40×HER2 ScDb1组（150μg/kg）；CD40×HER2 ScDb2组（300μg/kg）；曲妥珠单抗组（1mg/kg）。记录小鼠皮下肿瘤的体积的变化，对肿瘤组织进行石蜡包埋并切片，HE染色观察T6-17肿瘤组织细胞形态的变化。
　　结果：固相筛选法对噬菌体展示文库克隆的序列多样性发挥了收敛效果。第三轮筛选克隆的测序结果100%匹配的克隆占总克隆数的3.2%，并筛选获取了8个潜在阳性克隆，梯度噬菌体 ELISA检测各潜在克隆的亲和力表明，8＃克隆与CD40的亲和力最佳，其与 BSA亲和力的比值＞3，符合阳性克隆筛选的标准。PCR扩增CD40 ScFv的VH及VL片段，DNA电泳及测序结果表明CD40 ScFv的VH及VL碱基长度分别为345bp及324bp，与预期大小相符，重叠PCR拼接获取的CD40×HER2 ScDb基因序列长度为1464bp，与预期相符。使用0.5mmol/L IPTG可获得最佳蛋白诱导效果，蛋白变性电泳结果可于55Kd左右见一明显条带，其大小与预期相符，对His-tag进行Western Blot检测同样可于55Kd左右见一明显条带，BCA检测纯化后蛋白浓度为2.7mg/ml。流式细胞术检测Ag+CD40×HER2 ScDb组DC表面CD80、CD86及MHC-II的表达率分别为93.5±3.1%86.00±3.2%92.3±2.8%，与 Ag+TNF-α组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），与 NS组及Ag组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。ELISA检测Ag+CD40×HER2 ScDb组DC细胞上清中的IL-12浓度为659.90±61.28 pg/mL，与Ag+TNF-α组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），与 NS组及 Ag组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。Ag+CD40×HER2 ScDb组 T淋巴细胞对4T1细胞增殖的抑制率为75.65±2.53%，与 Ag+TNF-α组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），与 Ag组及NS组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。ELISA检测CD40×HER2 ScDb2组4T1肿瘤组织内 IL-12及 IFN-γ表达水平分别为448.85±51.10 pg/mL，273.44±44.60 pg/mL，与NS组及HER2 ScFv组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），与CD40 mAb组相比，无统计学差异（P＞0.05）。观察不同组小鼠4T1肿瘤体积的变化表明，CD40×HER2 ScDb2组(1.5mg/kg)及CD40 mAb(5mg/kg)均可显著抑制4T1肿瘤的体内增殖，二者的抑制效果无统计学差异（P＞0.05）。免疫组化检测肿瘤组织Cleaved-Caspase-3的表达水平，结果表明，CD40×HER2 ScDb组4T1肿瘤细胞内 Cleaved-Caspase-3的表达显著上调。CCK8检测CD40×HER2 ScDb对 T6-17细胞增殖的抑制结果表明， CD40×HER2 ScDb(5μg/mL)对 T6-17的抑制率为86.89±6.35%，其与曲妥珠单抗(15μg/mL)的抑制率85.56±1.73%相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。Western Blot检测不同干预组Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2的表达水平，结果表明，CD40×HER2 ScDb、HER-2 ScFv及曲妥珠单抗均可抑制 Akt、p-Akt、ERK1/2及 p-ERK1/2的表达，与NS组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。小鼠肿瘤组织HE染色结果表明，NS组细胞形态正常，细胞核完整，部分细胞可见核仁，细胞生长活跃，CD40×HER2 ScDb和曲妥珠单抗组肿瘤组织细胞失去正常形态，核固缩核碎裂现象明显。
　　结论：通过对抗CD40噬菌体展示免疫文库的筛选，可成功获取抗CD40高亲和力单链抗体克隆。通过重叠PCR可成功获取CD40×HER2 ScDb基因序列全长，通过IPTG诱导可成功于原核蛋白表达系统表达获取CD40×HER2 ScDb蛋白，并通过蛋白复性获得功能性蛋白。CD40×HER2 ScDb可通过促进DC细胞成熟，激活肿瘤特异性免疫，体外杀伤肿瘤，也可通过促进肿瘤特异性CTL在肿瘤组织巢集，通过激活肿瘤细胞内Caspase-3诱导肿瘤细胞凋亡，并通过上调组织内激活型免疫细胞因子激活肿瘤特异性免疫反应。CD40×HER2 ScDb可通过与T6-17表面的HER2结合，抑制Akt、ERK1/2的磷酸化，抑制T6-17的体外增殖，同时也可在体内通过HER2靶向功能抑制T6-17细胞的增殖。

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