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集中空调系统中弗朗西斯菌样细菌的多相分类学研究和另弗朗西斯菌属的建立

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前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、弗朗西斯菌的形态学特征及生理生化特征研究

1.1对象与方法

1.2 结果

1.3 小结

二、弗朗西斯菌的化学特征研究

2.1对象和方法

2.2 方法

2.3 小结

三、弗朗西斯菌的遗传学特征研究

3.1 对象和方法

3.2 方法

3.3 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:基因时代下细菌的多相分类

致谢

个人简历

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摘要

目的：
　　弗朗西斯菌属(Francisella)细菌是一种兼性细胞内寄生的革兰阴性菌球杆菌。该菌属模式菌种—土拉弗朗西斯菌，具有高度的致病能力和通过气溶胶传播的特性，被认为是一种潜在的生物恐怖细菌。其他的弗朗西斯菌种通常被认为是环境菌种、非致病菌或者机会性致病菌。近年来的研究发现，弗朗西斯菌广泛存在于自然界的淡水、咸水源和土壤中，其中人工供水系统中集中空调冷却水是一个新发现的生境。本研究旨在采用多相分类的方法，对分离自空调冷却水的弗朗西斯菌样细菌（SYSU10HL1970、10HP457、10HL1938、10HP82-10、SYSU YG23）进行生理生化、化学和分子生物学鉴定，确定其分类地位，便于评估其毒力、致病性和通过集中空调系统传播疾病的能力。
　　方法：
　　1.经典分类
　　采用传统实验方法进行氧化酶、触酶实验和 H2S还原实验等实验，以及采用API20NH、API ZYM和RapidID32A的试剂盒进行生化实验，E-test法检测抗生素敏感性。选择科内相近种的典型菌株 F. philomiragia ATCC25015、F. guangzhouensis08HL01032T作为参比菌株与供试菌株做平行实验，进行比较分析。
　　2.化学分类
　　采用薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱方法测定供试菌株的极性脂、呼吸醌、脂肪酸组分，选择科内相近种的典型菌株F. philomiragia ATCC25015、F. guangzhouensis08HL01032T作为参比菌株与供试菌株做平行实验，以比较分析。
　　3.分子分类
　　采用高效液相色谱（基因组DNA G+C mol％含量分析）、蛋白质谱、PCR扩增和基因测序相结合的核酸分析、DNA-DNA杂交等技术对供试菌株进行分子分类。根据分子分类的结果，该五株菌分类为2个菌群，SYSU YG23T和SYSU10HL1970T分别被指定为模式菌株（Type strain）。
　　结果：
　　1.经典分类
　　SYSU YG23T、SYSU10HL1970T、10HP457、10HL1938、10HP82-10五个供试菌株符合弗朗西斯菌科细菌的基本特征，其均为革兰氏阴性球杆菌，氧化酶阴性、触酶弱阳性且 L-半胱氨酸能促进其生长（CHAB培养基和嗜血杆菌巧克力培养基上菌落大于血平板）。具有与弗朗西斯菌科细菌类似的药敏特征：β-内酰酶试验阳性，对头孢菌素耐药，对氟喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类抗生素敏感。总体生化特征类似于广州弗朗西斯菌，但存在一定差异，如蔗糖发酵、亮氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、苯丙氨酸芳胺酶。
　　2.化学分类
　　SYSU YG23T、SYSU10HL1970T、10HP457、10HL1938和10HP82-10五个供试菌株的极性脂和醌组主要组分相同，主要含有磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine,PE）、双磷脂酰甘油（diphosphatidylglycerol, DPG）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol, PG）、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine, PC)、含氨基的未知磷脂（unidentified aminophospholipid, APL4，APL2）、未知磷脂（PL2, PL3和PL4）、未知糖脂（GL2）和少量的未知糖脂（GL1，GL3）。呼吸醌类型是Q-8，主要脂肪酸成分是C10:0、C14:0、C16:0和两个长链羟基脂肪酸C18:1ω9c和C18:13-OH，但在脂肪酸含量和种类上与参考菌株稍有不同，而且 SYSU YG23T和其它四个供试菌株在主要脂肪酸含量上有所区别，且 SYSU YG23T和其它四个供试菌株在主要脂肪酸含量上有所区别。
　　3.分子分类
　　16S rRNA基因比对结果显示：SYSU10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457的相似度为100%，与SYSU YG23T之间的相似度为98.6%；且两者与广州弗朗西斯菌08HL01032T的相似度最高，分别为98.87%和98.82%，但都与其他弗朗西斯菌种的相似度低于95.3%。以 MP、NJ和 ML三种方法构建的16S rRNA基因系统发育树均显示：该5株菌与广州弗朗西斯菌位于一个大的分枝上，与广州弗朗西斯菌分别形成3个小枝，其中SYSU10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457形成一个进化枝，SYSU YG23T单独为一个枝。
　　管家基因mdh、rpoB和 sdhA扩增成功，长度分别是700bp、300bp和300bp。基于单个管家基因及串联管家基因的系统发育树一致且与基于16S rRNA基因的系统发育树一致。即三个管家基因测序分析的结果亦表明，该五株可分为2个进化群，其分别与广州弗朗西斯菌亲缘关系密切，但又与广州弗朗西斯菌存在明显的差异。
　　MALDI-TOF MS的分析结果显示，SYSU10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457和存在特征的蛋白质谱峰5110m/z、6123m/z、9360m/z；SYSU YG23T存在特征的蛋白质谱峰5110m/z、4754m/z、6123m/z、9360m/z，且在4754m/z有峰，相对强度大于5110m/z峰相对强度。聚类分析显示，SYSU10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457形成一个聚类群，SYSU YG23T单独为一个聚类群。
　　基于细菌全基因组的分析结果显示：SYSU10HL1970T、10HL1938、10HP82-10和10HP457四株菌之间的杂交率>80%，即该四株菌为同一个种；与SYSU YG23T的杂交率在低于70%，即该四株菌与SYSU YG23T分别属于两个不同的菌种。另外，该五株菌与已知亲缘关系接近的广州弗朗西斯菌08HL01032T和蜃楼弗朗西斯菌也低于70%，亦支持其新属新种的分类地位。该两个新属新种的G+C mol%含量分别为：SYSU10HL1970T的G+C mol%含量为30.0%，SYSU YG23T的G+C mol%含量为32.6%。
　　结论：
　　根据经典分类、化学分类和分子分类的试验结果，SYSU10HL1970T（=KCTC42969= DSM101835）、10HL1938、10HP82-10、10HP457四株菌和SYSUYG23T（= KCTC42968=DSM101834)为弗朗西斯菌科的两个新属新种。根据细菌新种的命名法则，分别命名为冷却水另弗朗西斯菌（Allofrancisella frigidaquae）和意外另弗朗西斯菌（Allofrancisella inopinata）。另外，广州弗朗西斯菌08HL01032T（F. guangzhouensi）与其他弗朗西斯菌种存在差异，但与两个新属新种存在有许多共同点，所以将广州弗朗西斯菌重新划分入另弗朗西斯菌属内，命名为广州另弗朗西斯菌（Allofrancisella guangzhouensis）。

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