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【6h】

Wnt信号诱导人晶状体上皮细胞上皮间充质转化和增殖的研究

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摘要

目的：
　　后囊下混浊(posterior capsular opacification，PCO)是白内障摘除术后最常见的并发症，常常导致术后视力下降。晶状体上皮细胞上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition EMT)和增殖在PCO的发生和发展中起重要作用。Wnt配体蛋白参与调控细胞增殖、迁移及分化等众多生理过程，对人晶状体上皮细胞中Wnt3a介导的经典wnt信号通路目前研究甚少。本研究将wnt3a与经典wnt信号通路相关联，通过构建wnt3a过表达载体应用转染技术使人晶状体上皮细胞中过表达wnt3a配体蛋白，激活经典wnt信号通路，探讨其对晶状体上皮细胞EMT和增殖能力的影响，初步明确wnt在晶状体上皮细胞发生PCO的作用机制。同时，力求从中找到新的靶点。
　　方法：
　　1.构建Wnt3a过表达载体，转化大肠杆菌，酶切、测序进行鉴定。
　　2.应用Lipo2000转染技术转染Wnt3a过表达载体，人晶状体上皮细胞HLE B-3细胞和SRA01/04细胞过表达Wnt3a蛋白，用Western Blotting技术验证其表达。
　　3.用趋化运动实验和划痕实验检测Wnt3a过表达对晶状体上皮细胞的迁移运动能力影响。
　　4.采用MTT和流式细胞仪检测Wnt3a过表达对细胞增殖能力的影响。
　　5.用Western Blotting检测Wnt3a过表达后其下游信号分子β-catenin的活化程度。用免疫荧光的方法检测β-catenin在细胞中的定位情况，观察在Wnt3a刺激后，它们的分布变化，进一步明确Wnt/β-catenin信号通路的激活状态。
　　6.应用Western Blotting方法检测Wnt3a过表达对晶状体上皮细胞EMT标志蛋白和相关核内靶基因表达的影响，用免疫荧光的方法检测上皮和间充质标记蛋白在细胞中的定位情况，进一步明确Wnt/β-catenin信号通路在调控晶状体上皮细胞形成PCO中的分子机制。
　　结果：
　　1.成功构建Wnt3a-pcDNA3真核表达载体，基因测序与Genebank一致。
　　2.正常人晶状体上皮细胞系仅有少量Wnt3a表达。Wnt3a-pcDNA3瞬时转染后获得Wnt3a过表达晶状体上皮细胞系。
　　3.wnt3a过表达上调HLE B-3细胞内β-catenin的蛋白表达，并促使HLE B-3细胞和SRA01/04细胞内的β-catenin细胞定位由胞浆转入胞核。
　　4.与对照组相比，Wnt3a过表达的HLE B-3细胞和SRA01/04细胞的迁移运动能力比对照组细胞明显增强(P<0.01)。
　　5.Wnt3a过表达促进HLE B-3细胞和SRA01/04细胞的增殖(P<0.01)，细胞周期分析发现在S期细胞的比例升高。
　　6.与对照组相比，Wnt3a过表达的HLE B-3细胞和SRA01/04细胞的上皮表型E-cadherin表达降低，间质表型fibronectin表达升高；并且经免疫荧光实验证实，Wnt3a过表达的HLE B-3细胞和SRA01/04细胞发生EMT。
　　7.Wnt3a过表达使HLE-B3细胞和SRA01/04细胞中Wnt/β-catenin信号通路靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表达上调。
　　结论：
　　1.Wnt3a-pcDNA3真核表达载体能有效上调人晶状体上皮细胞Wnt3a蛋白的表达，使Wnt/β-catenin信号通路活化。
　　2.Wnt3a过表达能够增强晶状体上皮细胞的运动迁移能力。
　　3.Cyclin D1和c-Myc是Wnt/β-catenin信号通路的下游信号分子，Wnt3a通过激活Wnt/β-catenin信号通路，下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表达上调，促进晶状体上皮细胞增殖。
　　4.Wnt3a过表达诱导晶状体上皮细胞发生上皮间充质转化。

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