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大肠埃希菌Afa/Dr家族粘附素afa/draC基因片段的序列分析及流行病学调查

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摘要

目的：
　　 Afa/Dr家族粘附素主要表达于引发泌尿系统感染和婴幼儿慢性腹泻的尿道致病性大肠埃希菌和弥漫粘附性大肠埃希菌，与泌尿系统感染、感染性腹泻、呼吸系统以及其他系统的感染密切相关。本实验以大肠埃希菌临床分离株为研究对象，采用分子生物学方法，检测大肠埃希菌临床株Afa/Dr家族粘附素afa/draC基因片段的序列，明确是否存在突变位点，并应用Primer Premier5软件分析比对上述测序结果与相应的氨基酸序列变化情况；并对分离自泌尿系统、呼吸系统和消化系统的大肠埃希菌Afa/Dr家族粘附素携带率进行流行病学调查，为大肠埃希菌感染的临床防治探索可能的、新的思路。
　　 方法：
　　 1、菌株的收集、鉴定：收集2007年7月至2009年7月期间天津医科大学第二医院临床分离的大肠埃希菌，以及2009年5月至2009年10月期间于该院肠道门诊收集的部分腹泻病人便培养分离出的大肠埃希菌。采用常规的生化鉴定方法对收集菌株进行进一步鉴定。
　　 2、afa/draC基因片段PCR扩增、T-A克隆后序列分析：应用聚合酶链式反应（PCR）扩增20株临床分离的大肠埃希菌afa/draC基因片段，对PCR产物进行切胶回收纯化，T-A克隆后对克隆子再次进行PCR扩增，将产物测序结果与GenBank公布的序列进行比对，并将所测DNA序列翻译成氨基酸序列，分析氨基酸序列是否发生相应变化。
　　 3、大肠埃希菌Afa/Dr家族粘附素的流行病学调查：PCR方法扩增全部实验菌株的afa/draC基因片段，采用SPSS统计分析软件中卡方检验的方法，分析比较不同部位来源的大肠埃希菌afa/draC基因检出率有无统计学差异。
　　 结果：
　　 1、共收集大肠埃希菌600株，其中尿道分离菌261株，肠道分离菌244株，呼吸道分离菌22株，以及其他分泌物（血液、腹水等）分离菌73株。
　　 2、afa/draC基因片段PCR扩增、T-A克隆及序列分析：PCR产物电泳结果显示，50株临床分离的大肠埃希菌中20株PCR扩增产物条带位置与阳性对照菌的产物条带位置相符；T-A克隆后通过蓝白斑筛选方法得到克隆子-白色菌落，以克隆子DNA为模板进行PCR扩增后对产物进行序列分析；序列分析显示：20株临床分离菌株afa/draC基因片段序列与阳性对照株对比具有高度同源性（大于99％）；所测菌株均存在3～4处基因变异，变异位点分别为284G→T、308T→C、600T→C和620C→G且变异位点存在高度一致性；根据基因推导氨基酸序列并进行氨基酸比对后出现氨基酸的替代：Pro184→Ser和Gln190→His。
　　 3、在收集到的600株大肠埃希菌中，402株检测出该基因片段，其中，186株泌尿道分离菌，169株消化道分离菌，22株呼吸道分离菌，以及34株其他分泌物分离菌携带该基因片段，其携带率分别为71.26％、69.55％、59.09％、46.58％。将其携带率进行统计学分析，发现，只有泌尿道分离菌和消化道分离菌分别与其他分泌物分离菌的携带率比较时有统计学意义（P<0.05），其他各组别间差异没有统计学意义。
　　 结论：
　　 1、20株大肠埃希菌临床分离菌株afa/draC基因片段序列与阳性对照株对比具有高度同源性（大于99％），但所测菌株均存在3～4处基因变异，且变异位点存在高度一致性。因为扩增片段只占afa/draC全基因长度的26.05％，据此推测afa/draC基因全序列可能存在其他变异。基因位点变异导致部分相应的蛋白质氨基酸发生替换。大肠埃希菌afa/draC基因位点的突变有可能是由于地域不同、生理环境不同所产生的正常差异，属于基因位点变异。这种变异所产生的蛋白质氨基酸改变有可能不会影响蛋白质的结构和功能。
　　 2、600株临床分离的大肠埃希菌Afa/Dr家族粘附素携带率为67.00％，泌尿道、消化道和呼吸道来源的大肠埃希菌之间携带率没有统计学差异，但是前两者该家族粘附素的携带率分别高于其他来源的大肠埃希菌。这说明该家族粘附素是大肠埃希菌的一个主要的粘附素种类，在致病过程中具有十分重要作用。

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